下载文档原格式
中温α–淀粉酶酶活测定一、原理α–淀粉酶制剂能将淀粉链中的α-1，4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特性反应应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。
二、试剂和溶液1. 碘2. 碘化钾3. 原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。
4. 稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。
5. 可溶性淀粉溶液（20g/L）:称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。
溶液现配现用。
6. 磷酸缓冲液（pH=6.0）：称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和8.07g柠檬酸（C6H8O7·H2O）,用水溶解并定容至1000mL。
用pH计校正后用。
7. 盐酸溶液[c（HCL）=0.1mol/L]：按GB/T601配制。
三、仪器1. 分光光度计。
2. 恒温水浴：控温精度±0.1℃。
3. 自动移液器。
4. 试管：25mm×200mm。
5. 秒表。
四、分析步骤1. 待测酶液的制备称取1g~2g酶粉（精确至0.0001g）或准备吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液（2.6）充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液（2.6）充分研磨，最终样品全部移入定量瓶中，用磷酸缓冲液（2.6）定容至刻度，摇匀。
用四层纱布过滤，滤液待用。
注：待测中温α–淀粉酶酶液活力控制酶浓度在3.4u/Ml~4.5u/mL范围内，待耐高温α-淀粉活力控制酶浓度在60u/Ml~65u/mL范围内。
2. 测定---吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.00mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃（耐高温α-淀粉酶制剂于70℃±0.2℃）恒温水浴中预热8min；---加入1.00mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；---立即用自动移液吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速定其吸光度（A）.五、计算1. 根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。
《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》实验方案第二实验班一组组长：张金昌组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天2013．10.15α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测一、实验背景资料：1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。
2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。
广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
此酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。
4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。
酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。
吸附法是酶分子吸附于水不溶性的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可以反复使用。
5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。
由于六环炭的不规则排列，造成了活性炭多微孔体积及高表面积的特性。
硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。
具有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。
第4课时α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测考试要求知识内容考试属性及要求考情解读α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测加试1.尝试用吸附法制作固定化α－淀粉酶。
2.运用固定化α－淀粉酶进行淀粉水解的测定。
3.说明酶固定化的方法及制作原理。
4.通过此实验探讨固定化酶的应用价值。
一、固定化技术的基础知识1.酶：酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
2.固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
3.将酶改造成固定化酶的原因：酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
4.酶固定化的方法有：吸附法、包埋法、交联法和共价偶联法。
教材实验中用的是吸附法。
5.固定化酶作用的机理(如图)：将固定化酶装柱，当甲底物经过该柱时，在酶的作用下转变为乙产物。
解决学生疑难点1.固定化酶的优点是什么？答案固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。
酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。
2.根据图示连接固定化技术与原理答案A—b—ⅠB—a—ⅡC—c—Ⅲ3.下列所示的酶固定化技术中属于包埋法的是③④。
1.关于固定化酶技术的说法，正确的是( )A.固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B.固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应C.固定化酶中的酶无法重复利用D.固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术答案 D解析固定化酶技术就是将水溶性的酶利用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂，其优点是酶被固定在一定装置内可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应；在固定过程中，固定的是酶而不是反应物，因此A、B、C项均错误。
一题多变判断正误：(1)固定化酶可反复永久使用( )(2)不管是固定化酶柱还是固定化悬浮体，回收后，在一定条件下贮存，还可以利用( )(3)酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化( )(4)固定化酶可催化一系列的酶促反应( )答案(1)×(2)√(3)√(4)×题后反思直接使用酶和固定化酶的比较项目直接使用酶固定化酶制作方法－吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等是否需要营养物质否否酶的种类一种或多种一种催化反应单一或多种单一反应底物各种物质(大分子、小分子) 各种物质(大分子、小分子) 缺点对环境条件非常敏感，易失活；难回收，成本高，可能影响产品质量不利于催化一系列反应优点催化效率高、耗能低、低污染既能与反应底物接触，又能与产物分离；可以重复使用；可提高酶的热稳定性二、α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验1.α－淀粉酶的固定化(1)α－淀粉酶作用的最适条件：最适pH为5.5～7.5；最适温度为50～75_℃。
实验一α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。
二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。
三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。
3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70m L沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100m L。
此溶液需要当天配制。
注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。
4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。
配好后用pH计校正。
（二）仪器1. 分光光度计应符合GB9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。
实验四α.淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测1.固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
2.酶固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。
3．固定化酶的优点：（1）既能使酶与反应物接触，又能使酶与产物分离；（2)固定在载体上的酶可以被反复利用.4.淀粉遇碘显蓝色，糊精遇碘显红色，麦芽糖遇碘不显色。
1．固定化酶（1)概念:将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
（2）方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。
2．枯草杆菌的α淀粉酶的固定化(1)枯草杆菌的α.淀粉酶作用的条件：最适pH为5。
5～7.5;最适温度为50~75_℃.(2）方法：吸附法，介质是石英砂。
（3)淀粉水解作用的检测原理：错误!错误!错误!错误!错误!错误!错误!遇碘显蓝色遇碘显红色遇碘不显色3．α淀粉酶固定化实验步骤错误!↓错误!↓错误!↓滴加KI。
I2溶液,观察颜色，稀释1倍后再观察颜色↓错误!1．如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？提示:可在试管中加入1 mL可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。
如仍显蓝色,则流出液中没有淀粉酶.2．耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？提示：可以在高温下使淀粉水解快,而且酶不会因高温而失活，所以可在一些需要高温加热同时又要水解淀粉的反应中使用.3．判断下列叙述的正误（1)固定化α。
淀粉酶可永久使用（×）(2)用固定化α淀粉酶进行淀粉水解实验时不需考虑温度及pH 的影响（×)（3）α淀粉酶固定化实验结束后，将固定化柱放在常温下即可（×）错误!错误!错误!1．酶的固定化方法名称原理图示包埋法将酶或微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中,分为凝胶包埋法和微囊化法化学结合法利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上，分为交联法、共价结合法、离子结合法吸附法通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在醋酸纤维素、琼脂糖、多孔玻璃或聚丙烯酰胺等载体上2．直接使用酶和固定化酶比较1．下列关于固定化酶的叙述，错误的是( ) A．既能与反应物接触，又能与产物分离B．可催化一系列反应C．固定在载体上的酶可被反复利用D．酶的活性和稳定性受到限制解析：选B 固化酶能催化一种或一类化学反应，不能催化一系列的化学反应.2．淀粉在有关酶的作用下依次生成的物质是( )①糊精②葡萄糖③果胶④麦芽糖⑤蔗糖A．①②③④⑤B．⑤④①②③C．①③⑤② D．①④②解析：选D 淀粉水解过程为：淀粉错误!糊精错误!麦芽糖错误!葡萄糖，所以依次生成的物质是①糊精、④麦芽糖、②葡萄糖.3．下列有关淀粉水解作用检测的叙述，错误的是( ）A．实验后，反应柱可常温保存B．正常情况下,向流出液中滴加KI.I2溶液呈红色C．实验后,用蒸馏水洗涤反应柱，可洗去未反应的淀粉和产物糊精D．实验中，向反应柱中滴加淀粉溶液宜慢，使淀粉溶液以0.3 mL/min的流速过柱解析：选A 实验后，反应柱应低温(4 ℃)保存,以延长酶的寿命.4．在“α.淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验中α。
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测生科2班第一组一、背景知识酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶作用下转变为产物。
固定化酶技术的优点：使酶既能与反应物接触，又易与产物分离；固定在载体上的酶可以被反复利用。
固定化酶：1、固定化酶技术即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。
2、固定化酶技术的优点：（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。
（3）稳定性显著提高(热稳定性，对各种试剂的稳定性等)3、天然酶的缺点（1）天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活（2）溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本（3）反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用4.固定化酶方法固定化酶：就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
固定化的方法：对蛋白质有高度的吸附能力、有不引起蛋白质变性且能保持一定的酶活性，如：活性炭，多空玻璃，石英砂，有机硅等。
主要有以下四种，本实验所用的是第一种吸附法。
（1）吸附法物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂有机载体如纤维素，无机载体如活性碳、多孔玻璃等（酶与载体形成范德华力）备注：范德华力也叫分子间力。
分子型物质能由气态转变为液态，由液态转变为固态，这说明分子间存在着相互作用力，这种作用力称为分子间力或范德华力。
分子间力有三种来源，即色散力、诱导力和取向力。
色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。
一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。
