实 验7 酵母菌的形态观察
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实验7酵母菌的形态观察、大小测定和直接计数
一、实验目的
酵母菌的形态及出芽生殖，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；学习并掌握用测微尺测定微生物大小和使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理
1.酵母菌形态观察
酵母菌个体较大，常规涂片方法可能损伤细胞，因此用美蓝染液水浸片法观察其出芽生殖。
美蓝染液的氧化形式蓝色，还原形式无色。
活细胞由于新陈代谢，细胞内还原性物质还原美蓝而呈现无色，死细胞或代谢能力弱的细胞不能将美蓝还原呈现蓝色。
2.细胞大小测量
微生物大小的测定需借助测微尺：目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺用于矫正目镜测微尺，总长1mm，分100个小格，每小格10μm。
目镜测微尺是一块可放入目镜的圆形玻片，有50小格和100小格2种。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞的实际大小。
3.细胞计数
血细胞计数板，大格1.0mm，体积0.1m3。
三、步骤
1.酵母菌观察
1)在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液
于染液中，混合均匀。
2)加盖玻片。
3)将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和
出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。
4)染色约0.5h后再次进行观察，观察死细胞数量是否增加。
5)形态记录，计算0.5h后酵母菌的死亡率。
2.细胞大小测量
1)装目镜测微尺：把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒
内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
2)校正目镜测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
校正：先
用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
换成高倍镜进行校正。
计算：目镜测微尺每格长度（um）=两重合线间镜台测微尺格数x10 / 两重合线间目镜测微尺格数
3)菌体大小测定：目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母菌染色
制片。
先在低倍镜下找到标本，换高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。
测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的直径或宽和长所占目镜测
微尺的格数。
最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（在高倍镜下）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
4)取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别
用擦镜纸擦试干净，放回盒内保存。
3.细胞计数
1)以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
2)对计数板的计数室进行镜检，除去污染物，吹干。
3)加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将要
摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
4)加样后静止5min，先低倍在高倍观察计数。
以第二条边线(简称中线)为界，
接触到左侧中线与上端中线的细胞。
注意：菌液浓度适当，一般样品稀释度要求每小格约有5~10个菌体为宜。
每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。
如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。
计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
5)清洗血细胞计数板。
四、结果与讨论
1.酵母菌观察
视野1 活细胞30%，
视野2 活细胞25%，
视野3 活细胞25%，
视野4 活细胞30%。
酵母菌活细胞约占27.5%。
0.5h后，活细胞数量约占25%，表明有2.5%的酵母菌死亡。
酵母菌形态
2.细胞大小测定
实验中的酵母菌呈现椭圆形，比较接近圆。
3.细胞计数
中格中酵母菌数量：①17；②20；③16；④19；⑤20.
酵母菌数量：92×5×10000=4.6×106个/mL
五、回顾与总结
在美蓝染液鉴定活细菌时，可以适当滴加一滴蒸馏水，稀释蓝色，这样可以使活细胞更加明显。
这次实验中，掌握显微镜的使用十分重要，光线的调节对结果影响很大。
