实验五酵母菌的形态观察
13生物基地201300140059 刘洋2014-11-08
同组者：吕赞刘沛余马华峥
一、实验器材
1.菌种
酿酒酵母2d麦芽汁斜面培养物、酿酒酵母麦氏培养基产孢培养斜面培养物。
2.溶液和试剂
0.01%美蓝水溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、95%乙醇
3.仪器和其他用品
酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹，滴管，无菌水等
4.培养基
麦氏培养基、酵母合成培养基
二、实验目的
1.学习并掌握酵母菌一般形态和与细菌的区别。
2.观察酵母菌的出芽生殖，区分死活细胞。
3.学习酵母菌子囊孢子观察方法。
4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
三、实验原理
1.美蓝染液水浸片法
单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数采取出芽方式进行无性繁殖，液可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。由于细胞个体大，采取涂片的方法
制片有可能损伤细胞，一般通过美兰染液水浸片法或水—碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。同时，采用美兰染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴定。
美兰对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美兰由蓝色氧化型转变为无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老的细胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。
2.出芽生殖
酵母菌在出芽繁殖时会在母体上长出一个芽，芽体与母体相连，但从个体大小上讲一般比母体要小一些。酵母菌的芽殖过程开始于母细胞的细胞质和壁向外突出，进而细胞核以有丝分裂方式分成两个子核，一个子核留在母细胞内，另一个子核转移到突出部分，然后细胞在突出部分缢缩而生出芽体。芽体与母细胞暂时相连，并可以重复上述过程形成一个许多芽体彼此相连的群体。当芽体长到与母细胞大小相近时，从母体上脱落下来，成为完整的新个体。
3.子囊和子囊孢子染色
酵母菌是以形成子囊和子囊孢子进行有性繁殖的。两个临近的酵母细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成4个或8个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。经染色后子囊孢子呈绿色、菌体和子囊呈粉红色。
四、实验步骤
1.美蓝染液水浸片法
1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦
芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。
2)用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液
上。
3)将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞
颜色区分死活细胞。
4)染色后每隔一段时间再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。
2.子囊孢子染色
1)取一块载玻片，滴一小滴生理盐水于两个区域中央；用接种环无菌操作分别由枯草
芽胞杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔
的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。
2)涂菌面朝上，通过酒精灯火焰，直至形成一层肉眼可见的干燥菌膜。在用酒精灯烘
干时，应随时用手背接触载玻片，以控制其温度适中。
3)滴加孔雀绿染液覆盖1-2min，之后水洗。
4)滴加95%乙醇覆盖30sec，之后水洗。
5)滴加番红染液覆盖1min，之后水洗。
6)自然干燥并镜检。
五、注意事项
1.用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。
2.滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。
3.盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。
六、实验结果
美蓝染色后的酵母菌活体，其中蓝色的为已死亡酵母菌，可观察到出芽生殖。
出芽生殖
酵母菌子囊孢子染色，红色的为菌体，绿色的为子囊孢子
七、结果分析
1.酵母菌为单细胞微生物，其出芽生殖一次可生出多个芽体。
2.通过实验观察，时间越长酵母菌死活细胞的比例越大。
3.酵母菌子囊孢子的数目是偶数个。
八、思考题
1.根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液浓度及作用时间与酿酒酵母死活
细胞比例变化是否有关系？试分析原因。
虽然美蓝染液无毒，但是如果美蓝染色液作用时间过长或浓度过高，会造成酵母细胞脱水死亡，使得死活比升高。
2.酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性生殖外，还可以形成子囊孢子进行
有性生殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因。
观察到了，如果为观察到，可能是培养基条件不适宜。
九、附录
麦氏培养基配方（113℃灭菌30min）
酵母合成培养基配方（113℃灭菌30min，接种量10%）
