小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化

成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【期刊名称】《中国神经科学杂志》【年(卷),期】2004(20)5【摘要】目的从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞,并对其进行鉴定和诱导分化。

方法成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。

结果培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。

该克隆球具有很强的自我增殖能力,可多次传代。

免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白(Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。

结论本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖。

【总页数】5页(P363-367)【关键词】神经干细胞;巢蛋白;免疫组织化学;细胞培养;脊髓;小鼠【作者】郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【作者单位】第四军医大学基础部全军神经科学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定 [J], 高峰;贺世明;王学廉;高国栋2.C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 [J], 万丽;易桦林;贝伟剑3.成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定 [J], 张正卫;俞俊峰;王荣根;阮苗苗;张润洁;方斌;王冠;王盈;戴一凡4.人胎脑组织神经干细胞的分离培养、克隆和分化/EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响/小鼠脊髓重量和脊髓颈膨大截面积的基因组扫描分析[J],5.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一、实验目的本研究旨在探讨小鼠干细胞的生物学特性及其在组织再生和疾病治疗中的应用。

通过体外培养和观察小鼠干细胞，分析其增殖、分化和迁移能力，为干细胞在临床治疗中的应用提供理论依据。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）小鼠脾脏、骨髓等组织；（2）DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素；（3）小鼠成纤维细胞；（4）表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子；（5）流式细胞仪、细胞培养箱、倒置显微镜等。

2. 实验仪器：（1）流式细胞仪；（2）细胞培养箱；（3）倒置显微镜；（4）超净工作台；（5）离心机。

三、实验方法1. 小鼠干细胞分离（1）取小鼠脾脏、骨髓等组织，用眼科剪剪成1mm³大小的组织块；（2）将组织块放入DMEM/F12培养基中，加入Ⅰ型胶原酶，37℃消化1小时；（3）用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液；（4）用离心机离心，弃去上清液，用DMEM/F12培养基重悬细胞。

2. 小鼠干细胞体外培养（1）将细胞悬液接种于培养瓶中，放入细胞培养箱，37℃、5%CO2条件下培养；（2）每3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。

3. 小鼠干细胞表型鉴定（1）用流式细胞仪检测细胞表面标记，如CD29、CD44、CD45等；（2）用倒置显微镜观察细胞形态。

4. 小鼠干细胞增殖实验（1）取对数生长期的干细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板；（2）每24小时更换一次培养基，观察细胞增殖情况；（3）计算细胞增殖倍数。

5. 小鼠干细胞分化实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，诱导细胞分化；（2）观察细胞形态和生物学特性，如神经细胞、成骨细胞等。

6. 小鼠干细胞迁移实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入细胞迁移实验试剂；（2）观察细胞迁移情况，记录细胞迁移距离。

四、实验结果1. 小鼠干细胞分离成功，细胞生长旺盛，呈梭形、椭圆形等；2. 表型鉴定结果显示，小鼠干细胞表面表达CD29、CD44、CD45等干细胞标记；3. 小鼠干细胞增殖实验结果显示，细胞增殖倍数为10倍；4. 小鼠干细胞分化实验结果显示，细胞可分化为神经细胞、成骨细胞等；5. 小鼠干细胞迁移实验结果显示，细胞迁移距离为1.5mm。

第20卷第3期中 国 兽 医 学 报V o l.20,N o.3 2000年5月Ch inese　Jou rnal　of　V eterinary　Science M ay2000性成熟前小鼠生精细胞的发育过程张学明,文兴豪,赖良学,李德雪3,李子义,杨盛华,杜惜明,曾发贵　　(解放军军需大学动物科技系,吉林长春130062)摘要:用光镜、电镜观察了生后1～18d昆明白小鼠的生精上皮。

结果显示,生后1～3d,曲细精管内只有生殖母细胞和支持细胞2类形态结构截然不同的细胞,前者位于管中部;生后4～5d,少数生殖母细胞已附着在基膜上;生后6～7d,原始A型精原细胞大量出现并附着在基膜上;生后8d,A型精原干细胞大量出现,B型精原细胞开始出现;生后10d,B型精原细胞大量出现;生后12～13d,前初级精母细胞出现,少数曲细精管的管腔开始出现;生后14～15d,多数曲细精管管腔基本形成,前初级精母细胞大量出现。

本试验的结果表明,7～8d小鼠的睾丸最适于分离精原干细胞。

关键词:精原干细胞;形态结构;小鼠中图分类号:S852116 文献标识码:A 文章编号:100524545(2000)0320293205 精原干细胞的异体及异种移植是当前干细胞领域的一个新的研究热点。

但目前用于移植的细胞都是混合细胞,效率很低[1]。

若能将精原干细胞分离纯化,即可克服上述不足。

分离纯化精原干细胞必须选取合适日龄的睾丸,才能获取较多的细胞。

目前有关性成熟前小鼠生精上皮细胞生长发育所经历的形态结构的变化,尚缺乏系统的研究报道。

本试验系统观察了小鼠性成熟前各级生精细胞发育分化进程,以为选择合适日龄的小鼠睾丸分离纯化小鼠精原干细胞提供依据。

1　材料与方法111　动物的选择及饲养　昆明白小鼠,由本校实验动物中心提供,按常规方法饲养管理。

选择自然发情母鼠与公鼠合笼,次日8:00检查阴道栓,见栓日中午记为交配后(PC)0.5d,PC19d后确切记录幼鼠出生时间。

实用神经变性实验方法----成年鼠神经干细胞培养神经干细胞具有自我更新和分化成中枢神经系统不同类型细胞的能力。

体外分离培养和分析神经干细胞是揭秘神经发生的细胞和分子机制的重要方法,也有助于神经系统疾病和神经损伤干细胞治疗的条件优化。

成年哺乳动物脑内神经发生主要集中在两个区域:侧脑室室下区( subventricular zone of the lateral ventricle,SVz) 和海马齿状回的颗粒下层( subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampusSGZ)。

SGZ区的神经干细胞主要产生海马齿状回兴奋性谷氨酸能神经元。

SVZ区的神经干细胞产生抑制性的￥-氨基丁酸能神经元和嗅球的多巴胺能中间神经元除了分化为不同的神经元外,这两个区域的神经干细胞对神经营养因子、神经生理和病理刺激的反应性也不同,然而,这两个区域神经干细胞具有不同特性的分子机制并不十分清楚。

因此,比较同一个脑组织中,这两个神经发生区域神经干细胞的特征显得尤为重要。

近些年来,国际上相关领域的专家一直都在优化成年鼠神经干细胞的分离培养条件,但仍然存在很多的不足之处,如贴壁单层生长的细胞容易分化、所需的鼠脑数量较多等。

本文将介绍一种从一只鼠脑中同时分离培养DG区和SVZ区神经干细胞的方法。

1.材料8~12周雌性或雄性C57BL6J小鼠、Hank's平衡盐溶液(HBSS,购自Invitrogen, 货号14025126)、Neurobasal培养基(购自Invitrogen,货号210-049)、DMEM/F12培养基(购自Invitrogen,货号1032、B27添加物(购自Invitrogen,货号1750404),N2添加物(购自Invitrogen,货号17502-408,无菌分装)、Glutamax(购自Invitrogen,货号35050-038,无菌分装)、L-谷氨酰胺(购自Invitrogen,货号2503081,无菌分装)、青霉素/链霉素Antibiotic-antimycotic,自Invitrogen,货号15240-062,无菌分装)、碱性纤维生长因子(bFGF-2,购自Peprotech,货号100-18B-B)、表皮生长因子(EGF,购自Pepo Tech,货号100-15)、MACS神经组织分离试剂盒(购自Miltenyi Biotec,货号130-092-628)、β-巯基乙醇(购自EM Sciences货号MX0O31OMB-1,属剧毒品,在通风橱中打开)、Percoll分层液(购自Amersham Biosciences,货号17-0891-01)、10×DPBS(购自Invitrogen,货号14200-059)、1×DPBS(购自Invitrogen,货号14190-136)、多聚鸟氨酸(Poly-L--ornithine,购自SigmaAldrich,货号P-3655)、层粘连蛋白( Laminin,购自BD biosciences,货号354232) 维甲酸( Retinoic acid,RA,购自Sigma-Aldrich,货号R2625)、毛喉素( Forskolin FSK,购自Sigma-Aldrich,货号F6886)、二甲亚砜( Dimethyl Sulfoxide,DMSO,购自Sigma-Aldrich,货号D2650),超纯水( Mini Q)、75%酒精、4%多聚甲醛、细胞消化液(购自Accutase)、磷酸盐缓冲液(PBS)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brom2-deoxy Uridine, Brd)2.仪器6cm和10cm直径的细胞培养皿,离心管,1ml带滤芯的吸头,超低黏附6孔和24孔细胞培养板;解剖工具[眼科剪(购白Roboz,货号RS-5840、RS-6942),眼科镊(购自Roboz,货号RS-5237、RS-5095)];解剖显微镜;MclⅡ组切片机(购自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD,货号10180)及刀片Macsmix离心管混匀器(购自Miltenyi Biotec,货号130-090-753);无菌试纸(购自Fisher Scientific,货号14-959-92B);低速离心机(购自Eppendorf,型号5702,货号022626001);数字相差倒置显微镜(购自Olympus,CK41)。

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【摘要】目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。

方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。

结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。

结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。

【期刊名称】《长江大学学报：医学卷》【年(卷),期】2006(000)012【总页数】4页(P)【关键词】神经干细胞;培养;分化;中脑【作者】刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【作者单位】长江大学医学院;武汉大学医学院;武汉大学医学院;湖北荆州;湖北荆州;湖北武汉【正文语种】中文【中图分类】Q813神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的“发源地”[1]。

应用神经干细胞移植的方法修复神经系统脑的损伤与治疗人类神经退行性疾病中更显示出其优越性,其中最具有代表性的就是怕金森病，然而，这种方法在患者中广泛应用的障碍就是胚脑移植的问题。

本试验对小鼠胚胎中脑神经干细胞的分离和培养进行了尝试，为神经干细胞的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1) 实验动物孕12～13 d昆明小鼠(E12～13 d，SPF级)，由武汉大学医学院实验动物中心提供。

2) 试剂 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司；胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司。

GFP转基因小鼠神经干细胞脑出血小鼠脑内移植后对血肿周围血管生成的影响的开题报告背景：
脑出血是一种常见及严重的神经系统疾病，其主要病理特点是血肿和周围血管的破坏。

神经干细胞（NSCs）是特殊的多能干细胞，具有自我更新、增殖、分化修复受损神经组织的潜力，因此成为治疗脑出血的研究热点。

但目前尚不清楚NSCs移植后对血肿周围血管生成的影响。

研究内容：
该研究选择GFP转基因小鼠神经干细胞移植到脑出血小鼠脑内，观察移植后NSCs对血肿周围血管生成的影响。

具体研究内容如下：
1. 建立小鼠脑出血模型，并在不同时间点分别分离脑出血和周围组织。

2. 从GFP转基因小鼠中分离纯化NSCs，并进行标记、筛选、培养等操作。

3. 将获得的NSCs移植到脑出血小鼠脑内，观察移植效果及对血肿周围血管生成的影响。

4. 采用组织学方法，分析脑出血小鼠脑组织中随时间的变化，研究NSCs移植后对血肿周围血管生成的影响。

预期目标：
该研究通过NSCs移植的方式，探讨其在脑出血治疗中的潜在作用机制，为脑出血治疗提供新思路和治疗手段，为神经干细胞治疗其他神经系统疾病提供参考。

神经干细胞分离和培养（1）中枢神经系统及外周神经系统中都存在着一类具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞，在适当的条件下，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并表现相应的特化形态结构、表型和生物学特征[1~3]。

神经干细胞研究不仅可阐明神经发育的机制，而且在神经系统损伤修复和神经退行性疾病的细胞替代治疗以及基因治疗中都有巨大的应用价值[4~5]。

神经干细胞的体外培养、诱导定向分化研究及其在临床上的应用已成为神经科学的一个研究热点。

神经细胞具有黏附到它所接触的特异表面的能力，这种能力在它迁移至中枢神经系统适当部位的过程中，以及它的神经纤维延伸至合适的靶位中均起着重要的作用。

而这些细胞所接触的一些底物如某些细胞外基质，不仅作为迁移的物理性底物，而且也明显地影响了与其接触的细胞的特性，如细胞的分化等[6]。

本研究采用多聚鸟氨酸、层黏连蛋白和鼠尾胶原作为底物诱导神经干细胞的分化和迁移，并比较了这几种底物的作用特点，旨在探讨不同底物对神经干细胞分化的诱导以及对分化后细胞迁移能力的影响。

1 材料与方法1．1 材料动物：出生2~3d的Sprague-Dawley大鼠，由福建医科大学实验动物中心提供。

试剂：细胞培养基DMEM/F12、无血清培养基添加剂B27为美国Gibco公司产品，bFGF为美国Pepro Tech公司产品，层黏连蛋白为美国Collaborative公司产品，多聚鸟氨酸、小鼠抗BrdU单克隆抗体购自美国Sigma公司，小鼠抗巢蛋白（nestin）单克隆抗体为美国PharMingen 公司产品，BrdU购自博士德公司，小鼠抗微管相关蛋白2（MAP2）单克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、FITC标记二抗、罗丹明标记的二抗均为美国Chemicon公司产品，小鼠抗2，3-环核苷酸二酯酶（CNPas）单克隆抗体为美国Neo Markers公司产品，其他试剂均为美国Sigma 公司产品。

神经干细胞分离方法
神经干细胞的分离方法包括以下几种：
1. 磁性分选法：利用具有特定表面标记的磁性颗粒与细胞表面分子的特异性结合来实现分选。

常用标记为CD133和CD271。

2. 细胞贴壁法：将细胞放入含有富含营养物质的培养基中，等待细胞附着在培养皿上，然后通过培养条件的调节来富集干细胞。

3. 限制性稀释法：用高浓度神经干细胞培养基和一定密度的细胞进行稀释培养，由于细胞密度限制，只有神经干细胞能够继续分裂并形成神经球体。

4. FACS法：利用细胞表面标记物与流式细胞仪相结合进行单细胞分选。

以上方法各有优缺点，需根据具体实验目的和条件选择最适合的方法。

生殖干细胞的分离和鉴定生殖干细胞是一种重要的细胞类型，具有自我更新和多能分化的特性。

它们能够分化成几乎所有的细胞类型，包括神经细胞、心肌细胞等。

因此，生殖干细胞的研究具有重要的科学和医学价值。

本文将介绍生殖干细胞的分离和鉴定方法。

一、胚胎干细胞的分离胚胎干细胞是一种来源于早期胚胎的干细胞，具有自我更新和多能分化的特性。

分离胚胎干细胞首先需要获得早期胚胎的组织样本，例如培养皿中的原代胚泡(pluripotent embryonic stem cell, PESC)。

从这些样本中分离出单个细胞，通过培养和筛选，筛选出具有胚胎干细胞特性的细胞。

目前，主要的胚胎干细胞分离方法有两种：1. 脱粘法这种方法比较简单，其步骤主要包括用植物素或皮质激素等将细胞脱粘，并用未成熟支细胞与胚胎干细胞共培养。

然后，可通过一系列的鉴定方法，如 PCR、一维凝胶电泳、西方印迹等方法检验干细胞。

2. 细胞注射法这种方法是将单个胚胎细胞或系列细胞亚群注入到另一个同龄阶段的胚胎中，分化成胚胎干细胞。

这种方法流程复杂，技术要求也比较高。

二、生殖细胞的分离生殖细胞由于具有自我更新和多能分化的能力，因此也是干细胞的一种。

其分离方法主要应用于小鼠和人类。

1. 小鼠生殖细胞的分离小鼠生殖细胞分离的主要方法是使用细胞自动化器，当生殖细胞进入自动化器后，通过分离和筛选，最终得到生殖干细胞。

该方法较为简单，且得到的干细胞比较纯净。

2. 人类生殖细胞的分离对于人类生殖细胞的分离方法，目前尚未有较好的方法。

但是，一种新型的分离方法已经被提出。

该方法是使用细胞表面标记技术，即将表面标记的生殖细胞与微针结合，将生殖细胞从混合细胞中分离。

三、生殖干细胞的鉴定生殖干细胞是一种多能干细胞，因此需要通过鉴定的方式保证其纯度和多能性。

目前主要的鉴定方法有三类:1. 免疫细胞化学通过免疫标记对生殖干细胞进行鉴定，通过特异的标记，可以鉴定出生殖干细胞的存在和数量。

2. 分子生物学方法包括 PCR、一维凝胶电泳、DNA序列分析等方法。

小鼠大脑神经元的分离方法
对小鼠大脑神经元进行分离有多种方法，以下是其中一种常用的方法：
1. 麻醉小鼠：使用麻醉药物如氯丙嗪、异氟醚等来使小鼠进入无痛觉状态，以便进行手术操作。

2. 颅骨切除：使用麻醉后，通过手术将小鼠的颅骨切开，暴露出大脑。

3. 大脑组织取样：使用特殊工具，如小型锐器或吸管，小心地取出大脑组织，通常是取得海马或皮层区域。

4. 组织切片：将取得的大脑组织用冷生理盐水或培养液冲洗，并用冷却的切片盐水将其切片成较薄的切片。

5. 酶消化：将切片置于含有特定酶（如胰蛋白酶或Papain等）的酶溶液中，进行一定时间的消化作用，以分离神经元。

6. 分离过滤：将消化后的组织通过一系列滤网筛选，以除去残留的组织块和细胞碎片，得到单个神经元。

7. 细胞培养：分离的神经元可被收集并培养在适当的培养基中，提供必需的营养和生长因子，以促进其生长和存活。

需要注意的是，神经元的分离过程需要严格操作和适当的实验
室设备，以确保获得高质量的神经元。

同时，涉及到动物实验的操作，需要遵循相关伦理和动物保护的规定。

原代神经元细胞的分离培养（小鼠）
本实验是自己实验室平时做的（仅供参考）
实验材料的准备：出生24h以内的小鼠若干只；预冷的pbs（不含钙、镁离子）；DMEM（高糖）培养液（实验之前预热）；75%酒精；尖头镊子、小剪刀；含EDTA的胰酶（实验之前预热）；神经元细胞培养液；灭菌的1.5mlEP管若干只
实验阶段：（整个操作保持无菌）
1，取小鼠用酒精擦拭全身，用剪刀剪下小鼠头部，小心剥下头皮和脑壳后取出整个脑子放入预冷的pbs中（也可以把pbs放在冰盒上面）
2，用剪头镊子小心剥下脑膜、小脑和大脑中的血管后将其放进1.5mlEP管中
3，用小剪刀反复剪（感到手很累了为止），然后用1ml枪头将其加入预热的胰酶中，反复吹打几次后放进37℃ 5%CO2培养箱中孵育20min，期间晃一晃有利于重复消化
4，消化时间到了之后，用含血清的DMEM培养液终止消化后，用吸管反复吹大几次
5，过筛网：用大概200目的筛网过滤后，计数种于培养皿中（培养皿提前一天用多聚赖氨酸包被）（6cm dish种300w个为好）
6，24h后，换成神经元培养液，48h后加入5-氟-脱氧尿苷（终浓度20ug/ml），以后每3-4天换半液。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，具有重要的生理功能。

进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。

实验步骤：1.小鼠主星形胶质细胞原代培养（1）准备培养基：将DMEM/F12培养基配制好，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和20ng/mL生长因子（如EGF和bFGF），混匀即可。

将培养基过滤灭菌。

（2）小鼠灭菌和解剖：选取3-5天龄的小鼠，进行表面消毒处理，解剖小鼠颅脑组织。

（3）组织分离：将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中，使用去髓针将组织剪碎，加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。

（4）消化组织：使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化，将组织置于37°C的恒温槽中，用胶性吸管轻轻吹泡，约30分钟后停止消化。

（5）细胞分离：用离心机将细胞分离，将上清液收集到新的离心管中，用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。

（6）细胞计数：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数。

（7）细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中，加入预先配制好的培养基，放入培养箱中，37°C、5%CO2培养。

2.小鼠星形胶质细胞分离纯化（1）胶质细胞去除：在培养2-3周后，使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去，以保留星形胶质细胞。

（2）非星形胶质细胞去除：使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯，将细胞悬浮液转移到离心管中，使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来，再次离心。

（3）细胞计数和分装：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数并分装到新的培养皿中。

（4）鉴定纯化程度：使用免疫细胞化学方法，如免疫荧光染色，检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平，以确定纯化程度。

（5）细胞培养：将纯化后的星形胶质细胞继续培养，并进一步进行功能和机制的研究。