神经元培养步骤

Coverslips的清洗方法1.三蒸水浸泡过夜2.硝酸浸泡48小时, 硝酸每月更换一次。

（18h<时间<72h ）3.先用单蒸水冲洗几遍，将表面的硝酸洗去，然后用双蒸水洗8次，在摇床上摇90-100转，1小时换一次水。

最好能摇过夜。

4.干烤6小时，干烤温度为225度。

注：洗玻片这一步很重要，如果洗不彻底，细胞贴壁明显不好，并有聚团现象。

洗得过程中，请按照先放水，再放入玻片架，以免玻片互相粘在一起，洗不彻底。

换水时用PE手套，每次换水请更换PE手套，如洗的过程中有粘在一起的现象，请用镊子一个一个分开后，再继续洗。

5.在超净台，放到无菌培养皿里，封口膜封好6.用0.1mg/ml的PLL coat玻片，每个玻片100-120ul,过夜放置，60mm 加3ml，12孔板加1ml。

注：PLL最好不要使用超过1个月。

母液浓度1mg/ml，-20℃贮存，工作浓度0.1mg/ml（100ul母液+ 900ul ddH2O）7.种细胞前吸去多赖，用HBSS洗，2ml/well ，2-3次。

注：没有放coverslips的dish 不用洗，直接吹干就好了，30min 左右。

8.在Hood里自然干燥，不开紫外，紫外线可以分解多赖。

Preparation:1）冰盒，解剖工具（1把大剪刀，2 把尖镊子，2把尖嘴弯镊）泡在75%的酒精中消毒，100mm dish 2个，60mm dish 4个，细胞计数板，timer，1大1小两个塑料袋。

2）4个60mm dish每个放3ml左右HBSS置冰上，1个100mm dish 加入20ml左右DMEM全培置冰上。

3）打开37 C水浴，pre-warm HBSS，NB全培，0.25%胰酶（trypsin）学生值日准备工作1 预先查看是否有NB液及加B27的NB液2 查找并确定共需多少皿神经元，注意孵箱里保顾的待培养的皿，24孔板，6孔板等2 确定共需配制多少神经元培养液（即10% HS的全培）3 吸去待培养神经元的培养皿中的多赖并回收多赖，晾干4 配制神经元培养液，并加于各待培养的皿中，24孔板500ul，96孔板100ul神经元基础培养液：Neurobasal Medium + B27(2%，10ml/500mlNB，避光融化)神经元原代培养种植液50ml：DMEM + HS(5ml，10%)神经元培养液：神经元基础培养液 + GlutaMAX (125ul，100X，0.25%) + 双抗（1%，P-S，无血清）NB，0.25% trypsin，37℃预热。

神经元细胞培养1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。

2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。

重复上述步骤2～3 次。

5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。

6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。

7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。

(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。

（+0.5mmol/L谷氨酰胺）鉴定1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显。

2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。

这就更能支持2的阳性表达了。

4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！错误之处还请赐教！TUJ1。

一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。

神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。

二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。

2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。

3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。

三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。

2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。

3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。

四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。

2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。

4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。

5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。

6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。

五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。

2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。

3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。

4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。

六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。

2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。

神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。

孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。

剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。

皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。

胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。

以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。

每3天用吸管换液，一次换0.5mL。

体外培养8天细胞就能用于实验。

选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。

因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。

另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。

如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。

另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。

其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。

海马神经元培养（1）材料①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103)L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504)③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025)⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175)⑥trypsin 胰酶⑦NaHCO3⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝⑩巴氏吸管，前端用火抛光刻度吸管离心管闪烁瓶玻璃培养皿：小：3套大：2套冰袋、纱布手术器械、筛网培养瓶或培养板（2）步骤①准备a．配制试剂i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中）配制硼酸缓冲液（pH8.4）A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存4.5mlA液+5.5mlB液5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。

ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水NaHCO3：0.175g加入溶液1M NaOH 调节pH至7.2-7.4纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存iii）1M NaOH溶液配制NAOH：4g 溶于100ml纯水iv）0.125%胰酶+0.02%EDTAD-Hank’s溶液10mlEDTA 20mg 溶解后D-Hank’s溶液80ml胰酶125mg 溶解后1M NaOH溶液调节pH至7.2D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vii）10%FBS的DMEM/F12（D/F12）90ml D/F1210mlFBSviii）Neurobasal/2% B27-A （0.5 mM glutamine， 25 μM glutamate ）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25ml25mM glutamate： 0.1mlix）Neurobasal/2% B27-B （0.5 mM glutamine）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25mlb．消毒：手术器械：眼科剪、眼科镊、筛网培养皿：玻璃培养皿：小：3套，大：2套纱布闪烁瓶、离心管巴氏吸管、刻度吸管（培养瓶、盖玻片等）c．塑料培养瓶或培养板的清洗、紫外消毒d．Poly-D-lysine 包被：将配制好的P-D-L铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱1h或过夜。

海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。

(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。

4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。

2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。

3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。

4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。

30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。

5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。

过滤液DMEM，进入大离心管中。

离心800r，3min。

弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。

6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。

7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。

神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。

各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。

神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。

通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。

下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。

1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。

细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。

通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。

细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。

3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。

首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。

然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。

最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。

单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。

4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。

同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。

通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。

5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。

常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。

共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。

成年鼠皮质神经元培养方法
神经元是大脑中最基本的神经细胞类型，对于神经科学研究具有重要意义。

成年鼠皮质神经元的培养和维持对于研究神经系统疾病、药物筛选和神经再生等方面具有重要意义。

下面将介绍一种常用的成年鼠皮质神经元培养方法。

材料和方法：
1. 成年鼠的大脑组织。

2. 无菌生理盐水。

3. 0.25% 胰蛋白酶。

4. 0.1% DNase I.
5. 神经元培养基。

6. 神经元培养补充剂。

7. 聚-L-赖氨酸涂层的培养皿。

8. 离心管。

9. 离心机。

10. 显微镜。

步骤：
1. 收集成年鼠的大脑组织，并迅速置于无菌生理盐水中。

2. 将大脑组织切成小块，加入0.25% 胰蛋白酶和0.1% DNase
I 消化酶液中，在37°C下消化30分钟。

3. 用离心机离心，去除上清液，将细胞沉淀加入神经元培养基中。

4. 将细胞悬浮液均匀地滴加到聚-L-赖氨酸涂层的培养皿中，培养皿预先用神经元培养基预涂。

5. 将培养皿置于37°C的细胞培养箱中，培养2-3周，每周更
换一次培养基。

6. 使用显微镜观察神经元的形态和生长情况。

通过以上方法，可以成功地培养成年鼠皮质神经元，为神经科学研究提供了重要的实验材料。

这种方法可以应用于研究神经系统疾病的机制、药物的筛选以及神经再生的机制研究等领域，对于推动神经科学的发展具有重要的意义。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。

选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。

对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。

将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。

灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。

2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。

3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。

母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。

配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。

用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。

4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。

使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。

配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。

例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。

5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。

6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。

临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。

1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。

台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。

用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。

计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。

3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。

连续观察10 d, 并拍照记录。

神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。

原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。

为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。

以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。

1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。

一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。

在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。

2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。

使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。

3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。

然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。

然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。

4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。

培养基的成分可以根据具体需要进行调整。

细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。

在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。

5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。

在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。

例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。

此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。

6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。

这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。

这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。

7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。

例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。

（丁香园protocol 2008）一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。

神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O 和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。

二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min 自然晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。

原代神经元培养的概念一、神经元的获取原代神经元培养的第一步是从动物脑组织中获取神经元。

通常，新生动物（如新生小鼠）的脑组织被用于这一目的，因为新生动物的神经元具有较强的增殖能力。

获取的神经元可以通过酶消化或物理分散法进行处理，使组织分离成单个细胞。

二、培养基的选择培养基是原代神经元生长的必要条件，它提供了神经元所需的营养物质、激素和生长因子。

为了维持神经元的生长和存活，需要选择适当的培养基，以满足神经元的特殊营养需求。

常用的培养基有DMEM、MEM、F-12等。

三、培养条件控制原代神经元培养需要在一定的条件下进行，包括温度、湿度、气体（如O2和CO2）浓度等。

这些条件对神经元的生长和分化有重要影响，因此需要精确控制。

温度的稳定性对于维持细胞活性至关重要，而气体浓度则影响细胞的代谢和pH值。

四、神经元的生长与分化在适宜的培养条件下，获取的神经元开始生长并增殖。

在生长过程中，神经元会通过突起与其他神经元建立连接，形成复杂的网络结构。

随着时间的推移，这些神经元还会分化成不同的类型，执行特定的功能。

五、神经元网络的建立在原代神经元培养过程中，神经元会形成复杂的网络结构。

这些网络通过突触连接，传递电化学信号，模拟生物体内的神经网络。

通过观察神经元网络的建立，可以深入了解神经元的生长和功能机制。

六、培养过程中的监测与观察在原代神经元培养过程中，需要定期对细胞进行监测和观察，以了解细胞的生长状态、形态变化以及是否存在异常。

可以使用显微镜、电生理技术等方法对神经元进行监测。

通过这些手段，可以及时发现并解决培养过程中出现的问题。

七、培养物的应用与价值原代神经元培养在科学研究、药物筛选和疾病模型构建等方面具有广泛的应用价值。

通过原代神经元培养，可以深入了解神经系统的生理和病理机制，为药物研发提供有效的工具。

此外，原代神经元培养还为神经系统疾病的动物模型提供了替代方案，有助于研究疾病的发病机制和治疗方法。

总的来说，原代神经元培养是一种重要的实验手段，有助于推动神经系统科学的发展和进步。

神经元培养实验步骤：一准备：1 新生鼠出生24小时内（或胎鼠：师姐做的都是新生鼠，但外文文献都是胎鼠，胎鼠神经元存活率更高）2解剖液HBSS(g)Nacl 8.00Kcl 0.4Na2HPO4 0.0478KH2PO4 0.06Hepers 2.38定容到1000ml调PH至7.43.实验前一天灭菌耗材（看老鼠的肚子差不多估计快要生了）高压灭菌：器械，HBSS200ml，PBS或超纯水200ml,1ml枪头，200ml枪头，10ul枪头，5ml枪头，1.5mlEP管大于5个，5mlEP管大于5个，15mlEP管大于5个。

灭菌完毕后待HBSS，PBS或超纯水，4℃保存，其余器械耗材至于烤箱烤干。

包被培养板:0.1mg/ml多聚赖氨酸铺板，（一般四到六条海马一个六孔板，半脑皮层2块六孔板），培养箱内过夜。

4实验当天：解冻胰酶5ml，血清5ml1号超净台：冰盒加冰，器械，解剖显微镜，培养皿6cm2个，3cm （两个大脑一个皿）2号超净台：枪头，EP管，离心管，培养皿3cm2个，移液枪（包括5ml），酒精灯，废液缸2个75%酒精房间紫外照射至少30分钟，后通风10分钟二，操作步骤：1，取出多赖包被的培养板，吸干多赖，超净台内晾干（2号超净台）2，将HBSS取适量于培养皿中，至于冰上（1号超净台）3，培养基配制（2号超净台）种植液：50mlneurobasal＋1%P/S＋2%B27＋2%谷氨酰胺100×＋5%血清培养液：50mlneurobasal＋1%P/S＋2%B27＋2%谷氨酰胺100×＋2%血清（血清可以不加）4,3cm培养皿中加入2ml0.25%胰酶，放入培养箱中5，取1.5mlEP管4倍数个，分别加入1ml种植液（6条海马1ml）；皮层神经元5mlEP管2个（2半皮层2ml），分别加入2ml种植液。

放入培养箱中。

6，将晾干培养板用PBS或超纯水洗两遍，吸干，加入适量种植液7，取脑：去脑膜，分离海马皮层8，消化：海马一皿，消化13分钟，皮层用纤维镊夹碎，消化15分钟（9，中和洗涤：将皿稍倾斜，吸取组织至装有种植液的EP管中，上下颠倒洗涤，取沉淀再洗涤3次，取沉淀至第四管中，用1ml移液器吹散，轻柔，吹至无可见的组织块，若仍有组织块吹不散可用500rpm离心2-3分钟，取上清。

神经元培养流程：{准备需耗时3d}
1：早上紫外照板，傍晚铺板过夜，
2：吸板，晾板过夜
3：洗板，晾板过夜
4：上午种板，4小时后换液
1、取子宫放置于冰PBS烧杯1，用75％酒精浸泡2min
→取出胎鼠放置于冰PBS烧杯2
→断头于冰PBS烧杯3
→将头移入冰PBS平皿1，逐个取脑
→取脑放于冰PBS平皿2，剥离脑膜
→剥离完成将胚脑皮质移入冰PBS平皿3，剪碎
→加胰酶(1ml)、DNA酶(200μl)，37℃培养箱消化5~8min.
→种植液终止消化，种植液量=5×胰酶的量[胎牛血清量=胰酶的量]
→移入15ml离心管中轻慢吹打8次，静置2-3min，弃上层液
2、加4~5ml种植液吹打8次，静置2-3min，取上层液至50ml离心管中(此步骤重复2次)
3、取大皿4，置滤网于其中，将50ml离心管中收集的液体倒入200目滤网中过滤，收集过滤后的液体于15ml离心管中
4、离心机1000rpm,8min离心
5、弃上清，根据培养板孔数加入种植液，重悬，适量吹打
6、细胞计数
7、种板，置于37℃培养箱培养
8、4h后换液，种植液→培养液
9、3d后全量换液，以后每2-3d半量换液一次，每日在显微镜下观察细胞生长情况，培养至第7d后可用于鉴定及实验
5只胎鼠4个六孔板4个96孔板
注意：4h换液时摇晃一下，若悬浮很多，则用种植液清洗一次再换培养液。

皮层神经元的原代培养
一、背景
大脑皮层是调节躯体运动的高级中枢。

它由初级感觉区、初级运动区和联合区三部分构成。

人类大脑皮层的神经细胞约有140亿个，面积约2200平方厘米，主要含有锥体形细胞、梭形细胞和星形细胞（颗粒细胞）及神经纤维。

体外原代培养神经元作为神经科学研究的有力手段，越来越受到广大科研工作者的重视。

由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。

因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

二、实验步骤
1. 无菌条件下，从怀孕18天的SD 大鼠腹中取出胚胎放入预冷的无钙、镁平衡盐溶液中；
2.在解剖显微镜下，分离取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织（1mm3），加入0.125%胰酶-EDTA 消化液后放入 37℃孵箱内消化10 分钟，期间摇晃一次；
3.去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清；剩余沉淀加入终止液继续吹打5-10次;
4.所收集的上清过滤后，将细胞悬液于4℃1000rpm离心10min ，弃上清，管内加入新鲜培养液重悬；
5.台盼蓝染色计数，以 3 x 104cells/孔种入包被的24孔板，37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；
6.每周换液两次，每次半量换液。

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。

神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。

(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。

(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。

(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。

我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。

在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。

1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。

（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。

（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。

（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。

（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。

2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。