野生稻基因组随机扩增多态性DNA(RAPD)分析
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随机扩增多态性DNA反应体系优化的研究页数:3
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随机扩增多态性DNA页数:7
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DNA多态性分型技术页数:44
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第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用页数:7
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RAPD检查方法及意义
RAPD检查方法及意义
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA，是一种利用特定引物与无结构DNA作用，从而扩增出其特異或通用性DNA片段的技术。
它可以扩增出庞大的片段，也可以扩增出裂解服从于经典的单倍体型的微不足道的片段。
RAPD技术借助于PCR（聚合酶链反应）技术，可以仅用少量的DNA，用非特异性引物进行扩增，从而得到很多特定碱基序列，并测定这些片段在不同样本间的差异，有利于生物遗传信息学的研究。
RAPD技术的最大特点之一是能检测大范围内的遗传多态性，可以检测不同的DNA序列，RAPD技术使用的引物一般无特异性，也可以利用这些引物检测基因组中的不同位置的片段，从而在基因组结构与遗传多态性的研究方面，具有很大的潜力。
RAPD技术主要用在生物学的分子标记技术、基因组学、植物种质资源分子识别等方面，在动物育种，植物育种以及遗传改良，在动物种群族群结构研究中。
这种技术可以为鉴定和追踪遗传变异提供快速和高效的证据，为改善品种而进行的育种遗传改良和变异研究提供依据。
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释分子生物学考试重点一、名词解释1、分子生物学(molecular biology)：分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
2、C值(C value)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。
在真核生物中，C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物。
3、DNA多态性(DNA polymorphism)：DNA多态性是指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异。
4、端粒(telomere)：端粒是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，它是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体。
5、半保留复制(semi-conservative replication)：DNA 在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样形成的两个DNA分子与原来DNA 分子的碱基顺序完全一样。
一次，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA 的半保留复制。
6、复制子(replicon)：复制子是指生物体的复制单位。
一个复制子只含一个复制起点。
7、半不连续复制(semi-discontinuous replication)：DNA 复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是中断的、不连续的，因此称为半不连续复制。
8、前导链(leading strand)：与复制叉移动的方向一致，通过连续的5W聚合合成的新的DNA链。
9、后随链(lagging strand)：与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5\T聚合合成的新的DNA链。
10、AP位点(AP site)：所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖昔水解酶，它能特异性切除受损核昔酸上N-B糖昔键，在DNA链上形成去嘌吟或去嘧啶位点，统称为AP位点。
11、cDNA(complementary DNA)：在体外以mRNA 为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。
RAPD技术
RAPD分子标记的实验原理及操作流程RAPD标记RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul)。
二、实验设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。
三、试剂1、RAPD引物：购买成品或根据赛百盛（SBS）公司设计的RAPD引物序列（/pro11_1.asp）合成。
2、Taq酶3、10xPCR 缓冲液4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：1. 在15ul反应体系中，加入模板DNA 1ul (30-50ng)RAPD引物1ul (约5pmol)10xPCR Buffer 1.5ulMgCl21uldNTP 1ulTaq酶0.5单位（U）加ddH2O 至15ul混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
2. 在PCR仪中预变性94℃2分钟, 然后循环: 94℃1分钟，36℃1分钟，72℃1分钟，共40轮循环。
3. 循环结束后, 72℃10分钟，4℃保存。
4. 在15ul PCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ。
5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6. 用凝胶成像仪观察、拍照。
操作流程简图：注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法。
我国水稻种质资源创新研究与利用进展
植物遗传资源学报 2024，25 （4 ）：495-508DOI：10.13430/ki.jpgr.20231029001 Journal of Plant Genetic Resources我国水稻种质资源创新研究与利用进展杨德卫1，张海峰2，余文权3（1福建省农业科学院水稻研究所，福州 350019；2福建省农业科学院资源环境与土壤肥料研究所，福州 350000；3福建省农业科学院茶叶研究所，福州 350000）摘要：农业种质资源主要包括农作物、畜禽、农业微生物和药用植物等种质资源。
截止到2023年，我国保存的作物种质资源有超过54万份，其中有8万多份是水稻种质资源，如何对这么庞大的水稻种质资源进行精确评价与利用，这将对今后水稻种质创新与育种具有重要意义。
本文梳理了我国水稻种质资源收集、评价与精确鉴定、水稻新品系创制、水稻杂种优势利用、水稻种质创制新技术、新方法以及水稻优异基因资源的挖掘与利用等方面的进展，并归纳形成了水稻种质资源创制与利用的新模式。
最后，本文就当前水稻核心种质构建、种质资源鉴定与挖掘以及种质资源共享共赢机制等方面的问题进行了探讨，并就如何加强专用型核心种资的构建、种质资源的精确鉴定、种质资源的创新研究、种质资源的共享机制以及种质资源的合作交流进行了分析与展望，以期为进一步深入开展水稻种质资源鉴定评价与创新利用提供一定的参考和帮助。
关键词：水稻；种质资源；创新；利用；基因Progress on Innovative Research and Utilization of RiceGermplasm Resources in ChinaYANG Dewei1，ZHANG Haifeng2，YU Wenquan3（1Rice Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350019；2Institute of Resources， Environment and Soil Fertilizer， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350000；3Tea Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350000）Abstract：Agricultural germplasm resources mainly include crops，livestock and poultry，agricultural microorganisms and medicinal plants. There are 134，000 crop germplasm resources preserved in China， among which 74，000 are rice germplasm resources. How to accurately evaluate and utilize such huge rice germplasm resources is of great significance in rice germplasm innovation and breeding. In this paper，we reviewed the progress in collection，evaluation and accurate identification of rice germplasm resources，creation of new strains of rice，utilization of heterosis of rice，new techniques and methods of rice germplasm creation，and exploration and utilization of excellent genetic resources of rice，and summarized a new model of rice germplasm resource creation and utilization. Finally，this article discussed the current problems of rice core germplasm construction， germplasm resources identification and mining， and germplasm resources sharing and win-win mechanism. At the same time，we analyzed and prospeced how to strengthen the construction of specialized core seed resources， the accurate identification of germplasm resources， the innovative research of germplasm resources，the sharing mechanism of germplasm resources and the cooperation and exchange of收稿日期：2023-10-29 修回日期：2023-12-06 网络出版日期：2023-12-19URL： https：///10.13430/ki.jpgr.20231029001第一作者研究方向为水稻优异基因挖掘与利用，E-mail：***************通信作者：余文权，研究方向为茶树资源利用与茶文化，E-mail：****************基金项目：福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程（XTCXGC2021019）；院平台提升建设项目（CXPT20230003）；院东西部合作项目（DKBF-2024-12）Foundation projects：Fujian Agricultural High-quality Development Beyond the "5511" Collaborative Innovation Project （XTCXGC2021019）；Institute Platform Upgrading Project （CXPT20230003）； The College's East and West Cooperation Project （DKBF-2024-12）植物遗传资源学报25 卷germplasm resources， in order to provide some reference and help for further development of the identification，evaluation and innovative utilization of rice germplasm resources.Key words：rice；germplasm resources；innovate；utilization；gene农业种质资源又称遗传资源、基因资源，是指一切对人类具有实际或潜在利用价值的遗传材料［1］。
RAPD原理及操作
5.结果分析
观察各个样品间扩增条带的异同；
分析样品的相似性系数和亲缘关系，
作出它们的亲缘关系树状图。
1个反应的体积
18µl 2.5 µl 0.5µl 1.0µl 1.0 µl 2.0 µl 0.2 µl 25µl
终浓度
1× 2 mM 0.1mM 0.2 µM 10-20 ng 1U
3.RAPD-PCR
扩增程序为： 94℃，5’（预变性，保证模板能够彻底变性）； 94℃，40” → 38℃，1’ → 72℃，1’30”（35个循环）； 72℃ ，10’（后延伸，保证所有片段扩增完全）
RAPD技术的特点
1. 引物长度：常规PCR的引物长度为18-24nt（引物需要足够长， 保证序列独特性），但RAPD反应中所用的引物比较短(8-10nt)。 2. 扩增反应中只用一个引物，但实际起到两个引物的作用 。 3. DNA用量少，一般1ng/1µL 。
4. 退火温度较低（35－40℃），以利于多态性的检出。
表性技术为EST标记、SNP标记等。
RAPD标记的基本原理
1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息 的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性 DNA 标记
(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)，在种植资源研究、杂
种鉴定与遗传作图等方面有广泛应用。
RAPD 的具体原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链 (8-10nt) 为引物，以组织中分离出来的基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增。随机引物在基因组 DNA序列上有其特定结合位点， 一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变， 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增 产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电 泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组 相应区域DNA的多态性。
基于RAPD标记对71个柞蚕品种的聚类分析
柞蚕属于鳞 翅 目 （Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）天 蚕 蛾 科 （Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）的 绢丝类昆虫，我国境内的柞蚕在分类学上属于柞蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ），主要分布在 １０余个省份。目前保存着上百个地理种 群或生态类型，如山东的客岭庄种、河南的鲁山种、辽宁的瑷 阳种、贵州的湄潭种以及用颜色命名的青皮蚕、黄皮蚕、青黄 蚕、银白蚕、蓝靛蚕等 。 ［１］ 这些品种都是经过长期的人工选 择培育以及自然突变逐渐形成的具有不同生理、遗传特性和 区域适应性的柞蚕品种，其经济性状各具特征 。 ［２］
江苏农业科学 ２０１９年第 ４７卷第 １１期
刘丹梅，李文利，王丹丹，等．基于 ＲＡＰＤ标记对 ７１个柞蚕品种的聚类分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１１）：６１－６６． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．１１．０１２
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基于 ＲＡＰＤ标记对 ７１个柞蚕品种的聚类分析
收稿日期：２０１８－０２－０４ 基金项目：辽宁省自然科学基金（编号：２０１６０２１５７）；辽东学院博士启
动研究ห้องสมุดไป่ตู้目。 作者简介：刘丹梅（１９７３—），女，辽宁丹东人，博士，教授，主要从事基
因工程研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｄｌｉｕｄａｎｍｅｉ＠１６３．ｃｏｍ。
选育中，育成 ２个 多 丝 量 柞 蚕 新 品 种 。 ［１７］ 在 技 术 上，ＲＡＰＤ 技术已被应用在多种动植物上，如农志欢等在十大功劳属 ６ 个种上［１８］、李 言 等 在 海 带 上［１９］、石 洪 癑 等 在 中 华 绒 螯 蟹 上［２０］、陈德西等在蝗虫上［２１］都利用 ＲＡＰＤ技术开展了种质 资源的研究。目前，国内的研究主要集中在家蚕、玉米、水稻 等生物的种质资源方面，有关柞蚕种质资源遗传进化、分类以 及亲缘关系的研究在深度和广度上有待完善。因此，本研究 采用 ＲＡＰＤ技术对 ７１个柞蚕品种的分类和亲缘关系进行了 聚类分析，以确立品种间的亲缘关系，以期对我国这一特有生 物资源开展进一步的分子生物学研究。
华南农业大学农学院《生物技术》复习题(附答案)
华南农业大学农学院《生物技术》复习题（附答案）一、有关名词遗传标记指可稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。
遗传多态性现代遗传学中是指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异。
形态标记简单性状的遗传（普通遗传学）细胞学标记染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）生化标记同工酶与电泳技术（生化遗传学）同工酶是指具有功能相同而结构及组成有差异的一类酶分子标记DNA标记，以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。
PCR 聚合酶链式反应。
是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。
RFLP 限制性片段长度多态性。
不同样品DNA经限制性酶酶解所产生片段大小的差异。
RAPD 随机扩增多态DNA。
是以一个寡聚脱氧核苷酸单链作随机引物(primer) ，通过PCR扩增基因组DNA，获得长度不同的多态性DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性。
SSR 简单序列重复。
是一类由几个核苷酸组成的基序（motif）为重复单元串联组成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置。
AFLP 扩增片段长度多态性。
是一种通过限制性内切酶酶切DNA产生不同长度DNA片段，再结合PCR 技术来检测DNA多态性的分子标记技术。
FM遗传图谱又称遗传连锁图谱。
指反映基因组内基因(遗传标记)在染色体上线性排列顺序及其相对位置的图谱。
分子遗传图谱不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。
作图群体是指用于遗传作图的符合孟德尔定律的分离群体。
RIL群体即重组近交系群体，是由重组近交系组成的分离群体，由F2经多代自交一粒传使后代基因组相对纯合的群体。
DH群体是由通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术获得单倍体植株再经染色体加倍而获得的加倍单倍体群体。
主效基因又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。
微效基因是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位QTL，其性状表现为连续的变异。
随机扩增多态性DNA
SCAR （Sequencecharacterized Amplified Region） 标 记 是 Paran 和 Miehelmore(1993) 提 出 的 ， 首 次 在 RAPD(random amplified polymorphic DNA)标记基础上转化 并应用。发展该标记的初衷是为了提高RAPD标记在应用上的 稳定性。其基本原理是将RAPD标记片段从凝胶上回收并进行 克隆测序，根据其测得的序列结果设计一对特异引物，以此 特异引物对基因组 DNA进行再扩增，便可以得到能反映标记 性状的特异DNA片段，这种经过转化的特异DNA分子标记成为 SRAP。
无需专门设计扩增反应引物
仅加单个引物，扩增无特异性
退火温度低，有较高的检出率
技术简便易行、省时省力
分析所需的DNA 样品量，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定
性好、可重复性强
1 引物设计不合适
产生 RAPD 多态性位点发生在随机引物的退火区，当引
物在3'端加长后，加长的碱基有足够的同源性而克服了原 来RAPD引物而不能完全匹配 基因组上许多DNA序列是多拷贝的，如果获得的标记 是多拷贝，在SCAR 标记转化过程中，原来的标记位点多
2 序列相似或多拷贝 3 DNA甲基化
4 其他原因
态性在特异引物扩增后消失 原始标记具有的多态性在转化 SCAR 时多态性消失，
而且不同材料扩增核苷酸序列完全相同，DNA甲基化，虽然 基因表达调控发生变化，但核苷酸序列没有变化 SCAR标记表现为共显性，而且不同材料间扩增片段长 度差异较小，在琼脂糖凝胶上可能检测不到差异 回收的多态性片段中可能存在相同大小片段或 存在邻近 DNA片段污染
“
SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时
无需专门设计扩增反应引物
仅加单个引物，扩增无特异性
退火温度低，有较高的检出率
技术简便易行、省时省力
分析所需的DNA 样品量，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定
性好、可重复性强
1 引物设计不合适
产生 RAPD 多态性位点发生在随机引物的退火区，当引
物在3'端加长后，加长的碱基有足够的同源性而克服了原 来RAPD引物而不能完全匹配 基因组上许多DNA序列是多拷贝的，如果获得的标记 是多拷贝，在SCAR 标记转化过程中，原来的标记位点多
2 序列相似或多拷贝 3 DNA甲基化
4 其他原因
态性在特异引物扩增后消失 原始标记具有的多态性在转化 SCAR 时多态性消失，
而且不同材料扩增核苷酸序列完全相同，DNA甲基化，虽然 基因表达调控发生变化，但核苷酸序列没有变化 SCAR标记表现为共显性，而且不同材料间扩增片段长 度差异较小，在琼脂糖凝胶上可能检测不到差异 回收的多态性片段中可能存在相同大小片段或 存在邻近 DNA片段污染
“
SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时
分子生态学名词解释
一、翻译并解释名词：(10x4分)1.allele 等位基因一个位点的序列变异。
2.Effective population size (Ne) 有效种群大小在一个具有相等性比、随机交配的理想种群中表现出与特定统计（全部成体数目）规模相对应的真实的种群杂合性随时间丧失的速率相同的个体数。
3.F-statistics F 统计检验用于评估个体间、亚种群间和整个种群间杂合性的分布的统计方法，被广泛应用于定量亚种群的遗传分化。
4.Genetic load 遗传负荷相对于理论最佳值来说降低了的基因型适合度。
5.Hardy-Weiberg equilibrium哈温平衡当所有等位基因频率是已知的时候，在一个大的随机交配种群中的纯合子和杂合子的预期比例。
假设没有迁移、突变或选择作用，哈温平衡定律则认为等位基因频率从一个世代到下一个世代应该保持不变。
6.Bottleneck effect瓶颈效应种群的规模大为缩小，随后常常有一个（种群的）恢复。
7.Selection sweep选择扫荡。
课件：Occurrence of a beneficial mutation，Only individuals carrying the mutation reproduce，‘Population bottleneck’，Mainly affects linked loci。
8.IAM 无限等位基因模型其中突变不是以可预料的方式一个接一个发生，而大多数突变是像产生SNP（单核苷酸多态性）那样出现的。
9.Linkage disequilibrium (LD) 连锁不平衡。
术语表：Linkage equilibrium 连锁平衡：由重组促成的情形，其中遗传位点在繁殖期相互独立分离。
当两个位点上的等位基因一起分离时，如他们在同一个染色体上的物理位置太接近时，则发生不平衡。
百度：连锁平衡：HLA 不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的频率出现。
水稻农艺基因组图谱测定方法
水稻农艺基因组图谱测定方法水稻是世界上最重要的粮食作物之一，精确了解水稻基因组的结构和功能对于水稻育种和农艺改良具有重要意义。
水稻农艺基因组图谱的测定方法是一项关键的研究技术，本文将详细介绍水稻农艺基因组图谱测定方法的原理和步骤。
一、引物设计和PCR扩增在测定水稻农艺基因组图谱之前，首先需要设计适用于PCR扩增的引物。
一般来说，引物应具有高度特异性，可以选择在水稻基因组中能够扩增出满足条件的目标DNA片段。
引物的设计可以通过计算机软件进行，确保引物在水稻基因组中的特异性。
在引物设计完成后，接下来是PCR扩增。
PCR扩增是一种常用的DNA增殖技术，可以在短时间内扩增出特定的DNA 片段。
在水稻农艺基因组图谱测定中，PCR扩增将扩增出一系列特定目标基因的DNA片段，为后续的分析提供样本。
二、测序和序列拼接扩增出的DNA片段需要进行测序，以得到DNA序列的信息。
目前，高通量测序技术已经成为了测定水稻农艺基因组图谱的主要手段之一。
高通量测序技术能够同时测序大量的DNA片段，大大提高了测序效率。
在测序完成后，需要将得到的序列进行拼接。
由于高通量测序技术生成的序列长度较短，需要将这些短序列拼接成完整的DNA序列。
序列拼接的主要步骤包括序列质量控制、序列比对和序列拼接等。
三、基因组标记和基因组图谱构建测定水稻农艺基因组图谱的关键在于将得到的DNA序列进行基因组标记。
基因组标记是一种能够将特定的DNA序列与相应基因型相关联的技术。
通过基因组标记，可以在水稻基因组上确定特定位点的基因型差异，从而构建基因组图谱。
目前，基因组标记主要包括分子标记和SNP标记两种。
其中，分子标记包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单重复序列（SSR）和限制性片段长度多态性（RFLP）等。
而SNP标记则是一种以单核苷酸多态性为基础的标记技术。
基因组图谱的构建是基于基因组标记的，将基因组上的不同标记位点按照一定的顺序排列，形成一张图谱。