岩原鲤染色体核型分析

鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析1 范围本文件规定了鱼类染色体玻片标本的制备和组型分析的通用方法。

本文件界定了鱼类染色体组型分析的术语和定义，描述了染色体组型分析的原理、试剂和材料、仪器和设备、玻片标本的制备和组型分析。

本文件适用于鱼类种质鉴定。

2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1体细胞体外培养法somatic cell culture in vitro通过无菌操作，获取鱼的肾脏组织细胞或血细胞，在体外培养过程中，加入细胞分裂刺激物，刺激淋巴细胞大量进入分裂状态。

然后，加入适当浓度的秋水仙素，使细胞分裂被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂相。

3.2体细胞体内培养法somatic cell culture in vivo通过向鱼体内注射细胞分裂刺激物，刺激淋巴细胞大量进入分裂状态。

取出肾脏组织在生理盐水中将其充分剪碎或撕碎，再加入适当浓度的秋水仙素。

3.3体细胞直接法direct method of somatic cells将小鱼浸泡在适当浓度的秋水仙素溶液中，使其分裂旺盛的鳃丝上皮细胞被阻抑在分裂中期，而获得鱼类细胞染色体中期分裂相。

3.4胚胎细胞直接法direct method of embryo cells选用发育正常的囊胚期或原肠期早期胚胎，将其细胞吹打分散后，加入适当浓度的秋水仙素，将细胞阻抑在分裂中期，获得鱼类细胞染色体中期分裂相。

3.5空气干燥法air-drying technique将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后斜放静置，待其自然干燥。

3.6火焰干燥法flame-drying technique将收集的细胞经过低渗、固定、滴片，然后立即将玻片在酒精灯火焰上来回快速过火4次～5次。

实验一染色体核型分析染色体核型分析（Karyotype Analysis）染色体核型分析是一种常用的生物学实验技术，用于研究细胞的染色体数目、结构和形态。

通过染色体核型分析，可以检测染色体异常，诊断染色体疾病，并研究染色体的进化和遗传变异等重要问题。

一、染色体核型概述染色体是细胞核中的染色体主体，在细胞分裂时，染色体按形态、大小和着丝点位置等特征进行配对、对分和分离。

每个染色体通常具有一对相同的形态、大小和着丝点位置等特征的染色体称为同源染色体。

不同种类的细胞具有不同的染色体数目和形态。

例如，人体细胞核中共有46条染色体，其中包括23对同源染色体，其中22对为自动染色体，1对为性染色体。

通过染色体核型分析可以对染色体进行分类，了解其特征，为进一步研究染色体的结构和功能提供基础。

二、染色体核型分析的方法染色体核型分析的方法主要包括染色体制备、染色体着色和染色体观察等步骤。

（一）染色体制备染色体制备是染色体核型分析的关键步骤之一、常用的染色体制备方法包括：髓细胞染色体制备、外周血细胞染色体制备和组织细胞染色体制备等。

1.髓细胞染色体制备：将骨髓细胞进行培养、采集，离心沉淀细胞，用低渗透碘液进行溶解和沉淀，使用甘油进行固定，最后用酸性醇固定。

2.外周血细胞染色体制备：通过血液采集，将血中的白细胞离心沉淀，用低渗透碘液进行溶解和沉淀，使用甘油进行固定，最后用酸性醇固定。

3.组织细胞染色体制备：将组织细胞培养、离心沉淀细胞，用低渗透碘液进行溶解和沉淀，使用甘油进行固定，最后用酸性醇固定。

（二）染色体着色染色体着色是染色体核型分析的重要步骤之一、染色体着色方法主要有：Giemsa着色法、雷尼染色法、苏丹Ⅲ染色法等。

其中，Giemsa着色法是最常用的染色方法。

其原理是将染色体进行固定和醇解处理，再进行核蛋白、DNA染色，使染色体呈现出淡紫色或暗紫色。

（三）染色体观察染色体观察是染色体核型分析的最后一步。

可以使用显微镜对染色体进行观察和记录。

鲤鱼染色体组型的研究吕真(河南科技学院动物科学系，新乡，453003)摘要：方法：本文采用空气干燥法制备鲤鱼的中期染色体。

结果表明：鲤鱼染色体是二倍体，数目为2n=100，核型公式为：2n=22m+24sm+54st.t, 染色体总臂数NF=146。

结论：不同产地的鲤鱼核型之间存在差异。

关键词：鲤鱼染色体组型核型（Karyotype）是指染色体组在有丝分裂中期的表现，包括染色体的数目﹑大小﹑形态特征等。

按照染色体的数目﹑大小和着丝粒位置﹑臂比﹑次缢痕﹑随体等形态特征，对生物体内的染色体进行配对﹑分组﹑归类﹑编号等分析的过程称为染色体核型分析(Karyotype analysis)[1]。

对鱼类细胞染色体组型进行分析研究，不仅有助于了解生物的遗传组成，遗传变异规律和发育机制，而且对预测鉴定种间杂交和多倍体育种的结果，了解性别遗传机理以及基因组数，物种起源，进行种族关系的鉴定都具有重要的参考价值[ 2]。

早在本世纪三十年代就开始了对鱼类染色体的研究，以后，许多学者对大量鱼类的染色体组型进行过考察，在我国2千多种鱼类中已对约240种鱼的染色体核型作过介绍。

日本研究者Makino[3]曾以精巢为材料，以经典的切片方法，研究了鲤鱼的染色体，指出二倍体染色体数目为104，单倍体染色体数目为52。

后来Ojima和Hitotsumachi[4]以精巢与肾为材料，未经培养（直接法），采用低渗处理和空气干燥法制作染色体标本，对鲤鱼的染色体组型进行过分析,得出其二倍体染色体数目为100。

我国的相关研究是从八十年代才开始的，吴志安[5]﹑王蕊芳[6]﹑余先觉[7]等相继作出了有关染色体研究的报道。

本文对鲤鱼染色体核型进行研究分析，以期为鲤科鱼类种质资源的利用和保护提供基础资料，同时与以前的相关报道加以比较。

1．材料与方法1.1实验材料实验用鲤鱼（Cyprinus carpio）于2004年5月购于新乡市洪门镇市场，共6条，性别经过性腺鉴定为4雄﹑2雌，体重470—670g，体长25—32cm。

乌原鲤的胚胎发育特征韩耀全;何安尤;蓝家湖;吴伟军;李育森;王大鹏;雷建军;施军【摘要】通过干法授精获得乌原鲤受精卵,对其胚胎发育全过程进行连续观察.结果显示,乌原鲤成熟卵子呈圆球形、亮黄色、具黏性,卵径1.68~1.98 mm,吸水膨胀后卵径2.28~2.57 mm.水温(20 ± 1)℃时,受精卵至出膜时长为80.8 h,积温1616.0 ℃ ·h.乌原鲤胚胎发育与其他鱼类胚胎发育过程相似,历经受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成至出膜6阶段,各发育阶段所需积温分别为44.4、136.0、127.0、130.2、55.0、1123.4 ℃ ·h.出膜阶段历时47.45 h,初孵仔鱼自尾部破膜孵出,全长约6.10 mm,体高1.60 mm.温度对乌原鲤胚胎发育及出膜阶段影响明显,水温(20 ± 1)℃比水温(15 ± 1)℃胚胎仔鱼出膜时间更早、出膜更同步、出膜时段更集中.%The embryonic development was observed in fertilized eggs of Chinese ink carp Procypris merus by dry artificial fertilization under a microscope.It was found that Chinese ink carp had spherical,yellow and adhesive eggs with diameter of 1.68—1.98 mm,which were changed to2.28—2.57 mm in diameter due to water absorption.It took 80.8 h that the fertilized eggs were hatched from fertilization with an ac-cumulative temperatures of 1616.0 ℃ ·h at water temperature of(20 ± 1)℃.Like other fishes,the em-bryonic development of Chinese ink carp were divided into 6 stages:fertilized egg,cleavage,blastula,gas-trula,neurula and organogenesis,with accumulative temperatures of44.4,136.0,127.0,130.2,55.0 and 1123.4 ℃ ·h,respectively.The fertilized eggs were hatched first from tail in 47 h 27 min,and the newly hatched larvae had mean total length of 6.10 mm and body height of 1.60 mm.Theembryonic de-velopment and the hatching of Chinese ink carp were affected by water temperature,the earlier hatching and more synchronous and aggregation at water temperature of(20 ± 1)℃ than at(15 ± 1)℃.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】6页(P368-373)【关键词】乌原鲤;人工繁殖;胚胎发育【作者】韩耀全;何安尤;蓝家湖;吴伟军;李育森;王大鹏;雷建军;施军【作者单位】广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西都安瑶族自治县水产畜牧兽医局,广西都安530700;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021;广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021【正文语种】中文【中图分类】S917.4乌原鲤(Procypris merus)俗名乌鲤、乌钩、黑鲤、墨鲤等，属鲤形目、鲤科、鲤亚科、原鲤属，是珠江水系特有鱼类，仅分布于珠江流域西江水域部分干流及支流[1-2]。

第32卷 第2期V o l .32 No .2草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 2月F e b . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.02.011引用格式:肖孔钟,李 慧,晏键行,等.三种葱莲属植物的倍性及F I S H 核型分析[J ].草地学报,2024,32(2):444-449X I A O K o n g -z h o n g ,L IH u i ,Y A NJ i a n -x i n g ,e t a l .A n a l y s i s o f P l o i d y L e v e l s a n dF I S H K a r y o t y p e s o fT h r e e Z e p h y-r a n t h e s C u l t i v a r s [J ].A c t aA gr e s t i aS i n i c a ,2024,32(2):444-449三种葱莲属植物的倍性及F I S H 核型分析肖孔钟1*,李 慧2,晏键行1,杨丽洁1,雷 蕾1,3(1.南昌工程学院水土保持学院,江西南昌330099;2.南昌工程学院土木与建筑工程学院,江西南昌330099;3.江西省樟树繁育开发与利用工程中心,江西南昌330099)收稿日期:2023-7-11;修回日期:2023-10-19基金项目:江西省教育厅科技项目(G J J 2201514);江西省大学生创新创业训练计划项目(S 202311319002);南昌工程学院博士科研启动项目(2022k y q d 004)资助作者简介:肖孔钟(1993-)男,汉族,江西赣州人,博士,讲师,主要从事园林植物遗传育种研究,E -m a i l :2022994828@n i t .e d u .c n摘要:本研究以5S r D N A 为探针,利用F I S H 技术对3种葱莲属栽培品种有丝分裂中期染色体上的r D N A 位点进行物理定位,分析3种葱莲属栽培品种的倍性及F I S H 核型㊂结果表明:3个品种存在两种倍性,其中 L i l y Pi e s 和 F r a g r a n c e 为二倍体㊁ K i n g 's r a m s o n 为四倍体㊂它们的核型特点表现为:(1) L i l y P i e s 核型公式2n =2x=24=6m+18s m ,染色体相对长度范围为6.17%~12.80%,属于2B 型;(2) F r a g r a n c e 核型公式2n =2x =24=14m+10s m ,染色体相对长度范围为6.36%~12.08%,属于2A 型;(3) K i n g s r a m s o n 核型公式2n =4x =48=28m+20s m ,染色体相对长度范围为5.68%~13.55%,属于2B 型㊂3种葱莲属植物的F I S H 位点均位于染色体的长臂末端,分别为 L i l y P i e s 含有4个5S r D N A 位点,在6号和8号的两条染色上; F r a g r a n c e 含有3个5Sr D N A 位点,在两条6号染色体以及一条8号染色上; K i n g 's r a m s o n 含有4个5Sr D N A 位点,分别在一条2号染色体㊁两条6号染色体和一条8号染色体上㊂本研究对葱莲属3个栽培品种的倍性和F I S H 核型的分析,将为该物种的遗传多样性分析和基因组结构解析提供新的信息㊂关键词:葱莲属;倍性;染色体核型;5S r D N A ;荧光原位杂交中图分类号:S 682.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0444-06A n a l y s i s o fP l o i d y L e v e l s a n dF I S H K a r y o t y pe s o fT h r e e Z e p h y r a n t h e s C u l t i v a r s X I A O K o n g -z h o n g 1*,L IH u i 2,Y A NJ i a n -x i n g 1,Y A N GL i -ji e 1,L E IL e i 1,3(1.S o i l a n d W a t e rC o n s e r v a t i o n ,N a n c h a n g I n s t i t u t e o fT e c h n o l o g y ,N a n c h a n g ,J i a n gx i P r o v i n c e 330099,C h i n a ;2.S c h o o l o fC i v i l a n d A r c h i t e c t u r a l E n g i n e e r i n g ,N a n c h a n g I n s t i t u t e o fT e c h n o l o g y ,N a n c h a n g ,J i a n g x i P r o v i n c e 330099,C h i n a ;3.J i a n g x i P r o v i n c i a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c hC e n t e r o f S e e d -B r e e d i n g a n dU t i l i z a t i o no fC a m p h o rT r e e s ,N a n c h a n g ,J i a n gx i P r o v i n c e 330099,C h i n a )A b s t r a c t :I n t h i s s t u d y ,F l u o r e s c e n c e i n s i t uh y b r i d i z a t i o n (F I S H )w a s u s e d t o p h y s i c a l l yl o c a t e t h e 5Sr D -N Ar e p e a t o n t h em e t a p h a s e c h r o m o s o m e so f t h r e e Z e p h y r a n t h e s c u l t i v a r s .T h e p l o i d y a n dF I S H k a r y o -t y p e o f 3Z e p h yr a n t h e s c u l t i v a r sw e r e a n a l y z e d .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e t w o t y p e s o f p l o i d y i n t h e t h r e e c u l t i v a r s ,a m o n g w h i c h L i l y P i e s a n d F r a g r a n c e w e r e d i p l o i d a n d K i n gs r a m s o n w a s t e t r a -p l o i d .T h e k a r y o t y p e c h a r a c t e r i s t i c sw e r e a s f o l l o w s : L i l y P i e s k a r y o t y pe f o r m u l a 2n =2x =24=6m+18s m ,t h e r e l a t i v e l e n g t ho f c h r o m o s o m e r a n g e d f r o m6.17%t o12.80%,a n d t h ek a r y o t y p eb e l o n ge d t o2B t y p e .T h ef o r m u l a o f F r ag r a n c e k a r y o t y p e2n =2x =24=14m+10s m ,th e r e l a ti v e l e n gt ho f c h r o m o -s o m ew a s 6.36%12.08%,a n d t h e k a r y o t y p e b e l o n g e d t o 2At y p e .T h e f o r m u l a o f K i n g s r a m s o n k a r yo -t y p ew a s 2n =4x =48=28m+20s m ,t h e r e l a t i v e l e n g t ho f c h r o m o s o m e r a n g e d f r o m5.68%t o13.55%,a n d t h ek a r y o t y p eb e l o n g e d t o 2Bt y p e .T h eF I S Hl o c i o f t h e t h r e e s pe c i e sw e r e l o c a t e da t t h e e n dof t h e l o ng a r mo f th e c h r o m o s o m e ,s h o wi n g t h a t L i l y Pi e s c o n t a i n e d f o u r 5S r D N A l o c i ,w h i c hw e r e o n t w o h o -m o l o g o u s s t a i n s o fN o .6a n dN o .8,r e s p e c t i v e l y . F r a gr a n c e c o n t a i n e d t h r e e 5Sr D N Al o c i ,w h i c hw e r e o n t w o h o m o l o g o u s c h r o m o s o m e s o fN o .6a n d o n e s t a i n o fN o .8. K i n gs r a m s o n c o n t a i n e d f o u r 5S r D -N Al o c i ,w h i c hw e r e o no n e o nN o .2,t w o o nN o .6a n d o n e o nN o .8.I n t h i s s t u d y ,t h e p l o i d yl e v e l s a n d t h eF I S Hk a r y o t y p e s a n a l y z e d i n t h r e e c u l t i v a r s o f Z e p h yr a n t h e s w o u l d p r o v i d e n e w i n f o r m a t i o n f o r t h e a -第2期肖孔钟等:三种葱莲属植物的倍性及F I S H核型分析n a l y s i s o f g e n e t i c d i v e r s i t y a n d g e n o m e s t r u c t u r e o f t h i s s p e c i e s.K e y w o r d s:Z e p h y r a n t h e s;P l o i d y;K a r y o t y p e;5S r D N A;F l u o r e s c e n c e i n s i t uh y b r i d i z a t i o n葱莲属(Z e p h y r a n t h e s)植物,全属大约70种,广泛分布于美洲大陆㊁印度群岛和墨西哥等地[1-2]㊂该属植物大多具有较高的药用价值,全草含多种生物碱,包括石蒜碱㊁多花水仙碱㊁尼润碱等,具有抗癌㊁抗真菌和抑菌活性[3]㊂除了它们的药用价值以外,更为突出的是它的观赏价值,在我国园林绿化中广泛栽培[4]㊂在夏季由于暴雨带来的大量水分或急剧降温,会出现大量开花的现象,因此也被称为风雨兰或雨百合[5]㊂在分类学上,葱莲属是一个多样性很强的属,种间具有较小的区别且形态上非常相似㊂现有的约50种葱莲属植物的染色体数据库表明,葱莲属是一个进化活跃的属,这从它的染色体基数种类繁多,且各基数相互之间没有规律[6]㊂其染色体基数有x= 5,6,7,8,9,12,13,16,19[7]㊂同时它的体细胞染色体数也具有广泛变异,有从Z.s e u b e r t i i的2n=10到园艺杂交种的2n=200之间变化[8]㊂我们常见的葱兰(Z.c a n d i d a)就含有染色体数目2n=38,40, 41的报道[9]㊂此外,该属里的某一部分物种,常常会出现结构变化而导致染色体核型异常的现象[9]㊂目前市场上流行的葱莲属植物大多是以栽培品种的形式出现,而对于它们的来源以及倍性特点的报道较少㊂为了减少育种的盲目性,因此,有必要去了解流行品种的倍性以及亲缘关系的远近特点㊂随着分子细胞遗传学的发展,荧光原位杂交技术(F l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n,F I S H)可实现染色体的识别和定位,这一技术已成功应用在百合属㊁大麦属㊁六出花属㊁芸苔属㊁拟南芥属等多种植物中进行染色体的来源分析与基因渗入鉴定[10-11]㊂本研究通过对3种葱莲属栽培品种的倍性以及染色体F I S H分析,建立了葱莲属植物的5Sr D N A标记的细胞遗传学核型图,为葱莲属植物的遗传多样性分析㊁基因组结构研究提供信息㊂1材料与方法1.1植物材料3个葱莲属植物栽培品种 L i l y P i e s F r a-g r a n c e K i n g s r a m s o n ,购于浙江虹越花卉有限公司㊂3个品种均由印尼进口,主要应用于我国的园林绿化以及家庭盆栽中,种植于南昌工程学院生态科技园,进行常规水肥管理㊂1.2试验方法1.2.1染色体制片染色体制片参照X i a o等[12]的方法㊂将3种植物种植在泥炭土中进行发根,待新生的幼根在2c m左右取下㊂用0.7m m o l㊃L-1的放线菌酮处理4h,然后置于卡诺固定液固定至少12h,再进行酶解㊁压片㊁冰冻㊁揭片㊁脱水㊁干燥㊁镜检等步骤㊂而后将制片放入4ħ冰箱备用㊂1.2.2荧光原位杂交5S r D N A重复序列探针5'-G G A T G C G A T C A T A C C A G C A C T A A T G C A C C G G A-T C C C A T C A G A A C T C C G C A G T T A A G C G T-3'双端进行T A M R A(红色)标记,由北京擎科生物有限公司合成㊂原位杂交步骤:(1)配制杂交液,杂交液由2μL 20ˑS S C(3m o l㊃L-1N a C l和0.3m o l㊃L-1柠檬酸钠组成,p H值=7)㊁4μLd e x t r a n s u l f a t e(硫酸葡聚糖)㊁2μL5S r D N A探针㊁12μLd d-H2O组成;(2)杂交:将杂交液混匀加在1.2.1步骤中制备好染色体的载玻片上,迅速盖好盖玻片在37ħ湿润保温盒中孵育6h;(3)洗片:42ħ下用2ˑS S C洗涤3次,每次5 m i n;(4)封片:将洗好的玻片风干,再每张制片滴加10μL含有D A P I(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的封片剂封片㊂最后在显微镜荧光模式下观察拍照㊂蓝紫色为染色体,红色为5S r D N A信号位点㊂1.2.3染色体核型参数计算方法(1)染色体长度:X总长=ΣX短臂长+ΣX长臂长,X相对= (ΣX短臂长+ΣX长臂长)ː(X总长)ˑ100%㊂进行核型分析时,长度一般取X相对㊂(2)核型不对称系数:A sˑK%=ΣX长臂长/X 总长㊂(3)臂比和着丝点位置:臂比:A R=X长臂长/ X短臂长;染色体类型依据着丝粒位置进行分类,采用S t e p h e n s等[13]的标准,如表1所示㊂表1染色体类型分类表T a b l e1 C h r o m o s o m e t y p e c l a s s i f i c a t i o n臂比值着丝点位置简写A r mr a t i o C e n t r o m e r e p o s i t i o n A b b r e v i a t i o n1.01~1.70中部着丝点区(M e t a c e n t r i c)m 1.71~3.00近中部着丝点区(S u b-m e d i a n)s m 3.01~7.00近端部着丝点区(S u b-t e r m i n a l)s t 7.01以上端部着丝点区(t e r m i n a l)t(4)平均臂比:A V G(A R)=ΣA R/n(5)核型分类:根据染色体的臂比和长度比将核型分为12类[13],如表2所示㊂544草 地 学 报第32卷表2 核型分类T a b l e 2 K a r y o t y pe c l a s s if i c a t i o n 染色体长度比(最长/最短)C h r o m o s o m e l e ng th r a ti o (L o n ge s t /s h o r t e s t )臂比大于2ʒ1的染色体所占百分比T h e c h r o m o s o m e r a t i oof l o n g/s h o r t a r m s >2ʒ10.00.01~0.50.51~0.991.0<2ʒ11A 2A 3A 4A 2ʒ1~4ʒ11B2B3B4B>4ʒ11C 2C 3C 4C 2 结果与分析L i l y Pi e s 的体细胞数目㊁F I S H 核型及核型模式图(图1a ),核型参数如下表(表3)㊂ L i l y P i e s 为二倍体,体细胞含有24条染色体,染色体基数x =12,核型公式为2n =2x =24=6m+18s m ㊂有6条 m 型和18条 s m 型染色体组成㊂染色体的相对长度在6.17%~12.80%之间,染色体最长/最短为2.07,长臂/短臂平均为1.83,核型不对称系数为63.85%,臂比值大于2的染色体占33.33%,核型分类为2B 型(表4)㊂利用5Sr D N A 的F I S H 实验,得出 L i l y P i e s 含有4个5Sr D N A 的信号位点,分别是在6号和8号同源染色体的长臂末端㊂ F r a gr a n c e 的体细胞数目㊁核型及核型模式图如下图(图1b ),核型参数如下表(表3)㊂ F r a -gr a n c e 为二倍体,体细胞含有24条染色体,染色体基数x =12,核型公式为2n =2x =24=14m+10s m ㊂有14条 m 型和10条 s m型染色体组成㊂染色体的相对长度在6.36%~12.08%之间,染色体最长/最短为1.90,长臂/短臂平均为1.81,核型不对称系数为63.56%,臂比值大于2的染色体占33.33%,核型分类为2A 型(表4)㊂利用5Sr D N A的F I S H 实验,得出 F r a g r a n c e 含有3个5Sr D N A 的信号位点,分别是在6号的两条同源染色体和8号的一条染色体上,均位于染色体的长臂末端㊂K i n g's r a m s o n 的体细胞数目㊁核型及核型模式图如下图(图1c ),核型参数如下表(表3)㊂ K i n g's r a m s o n 为四倍体,体细胞含有48条染色体,染色体基数x =12,核型公式为2n =4x =48=28m+20s m ㊂有28条 m 型和20条 s m型染色体组成㊂染色体的相对长度在5.68%~13.55%之间,染色体最长/最短为2.39,长臂/短臂平均为1.60,核型不对称系数为60.42%,臂比值大于2的染色体占8.33%,核型分类为2B 型(表4)㊂利用5S r D N A 的F I S H 实验,得出 K i n g's r a m s o n 含有4个5S r D N A 的信号位点,分别是在2号的一条同源染色体㊁6号的两条染色体和8号的一条染色体上,所在染色体上的位置均位于长臂末端㊂由此可知,3个葱莲属植物存在两种不同的倍性,分别为二倍体和四倍体㊂利用荧光原位杂交技术,鉴定了这3个品种的5S r D N A 所在染色体上的位置发现,3个品种的5Sr D N A 位点数量不相同,其中 L i l y Pi e s 的位点在同源染色体上对称分布,表现出原始种的特性;而另外2个栽培品种信号位点在同源染色体上非对称分布,它们可能是通过杂交或远缘杂交的方式选育而来的杂交种㊂通过比较5S r D N A 信号的位置,发现它们具有的共同的特点是,所有的5Sr D N A 信号均位于染色体的长臂端部,并且6号染色体均含有5S r D N A 的信号㊂结合5S r D N A 信号所在的位置以及信号强弱可以得出,5S r D N A 在葱莲属植物中表现出一定的位置保守性,但在拷贝数方面已显示出差异㊂表3 葱莲属3个品种的染色体组型T a b l e 3 T h ek a r y o t y p e p a r a m e t e r s o f t h r e e Z e p h yr a n t h e s s p e c i e s 名称N a m e染色体编号N o .o f c h r o m o s o m e 相对长度(L+S =T )R e l a t i v e l e n g t h (L+S =T )/%臂比(L /S )A r mr a t i o (L /S )着丝点类型C e n t r o m e r e t y p e 染色体编号N o .o f c h r o m o s o m e 相对长度(L+S =T )R e l a t i v e l e n g t h (L+S =T )/%臂比(L /S )A r mr a t i o (L /S )着丝点类型C e n t r o m e r e t y pe L i l y Pi e s 15.56+7.24=12.8 1.3m 7 2.59+6.63=9.22 2.56s m 2 3.73+6.78=10.511.82s m 8 2.59+4.80=7.39 1.85s m 3 3.58+6.63=10.211.85s m 9 2.51+4.65=7.16 1.85s m 43.05+3.50=6.551.15m 10 2.51+4.50=7.01 1.79s m 52.82+3.35=6.171.19m 11 2.29+4.57=6.86 2.00s m 62.74+5.79=8.532.11s m 12 2.17+5.41=7.58 2.49s mF r a gr a n c e 1 5.29+6.80=12.081.29m 7 2.89+4.22=7.11 1.46m 2 3.78+6.36=10.131.68m 8 2.77+3.59=6.36 1.30m 3 3.46+7.30=10.762.11s m 9 2.45+3.96=6.42 1.62m 43.21+5.35=8.561.67m 10 2.33+6.67=9.00 2.86s m 52.96+4.41=7.361.46m 11 2.20+4.85=7.05 2.20s m 63.02+5.35=8.371.77s m 12 2.08+4.72=6.80 2.27s mK i n g's r a m s o n 1 5.99+7.56=13.551.26m 7 3.04+4.57=7.61 1.50m 2 4.92+6.09=11.011.24m 8 2.99+3.45=6.44 1.15m 33.60+6.34=9.941.76s m 9 2.69+4.82=7.51 1.79s m 43.20+5.68=8.881.78s m 10 2.69+2.99=5.68 1.11m 53.20+5.07=8.271.59m 11 2.44+4.41=6.85 1.81s m 63.09+5.07=8.171.64m 12 1.73+4.36=6.09 2.53s m644第2期肖孔钟等:三种葱莲属植物的倍性及F I S H核型分析图1 3种葱莲属植物有丝分裂中期染色体F I S H 分析F i g .1 F I S Ha n a l y s i s o nm e t a p h a s e c h r o m o s o m e s o f t h r e e Z e p h yr a n t h e s s p e c i e s 注:(a ) L i l y P i e s ;(b ) F r a g r a n c e ;(c ) K i n g s r a m s o n ;图中①②③分别代表中期染色体分布图㊁核型模式图和核型图;5Sr D N A 信号为红色,图中白色箭头指示;染色体用D A P I 染成蓝色㊂标尺=10μmN o t e :(a ) L i l y P i e s ;(b ) F r a g r a n c e ;(c ) K i n g s r a m s o n ;I nt h e f i g u r e ,①,②a n d ③r e p r e s e n tm e t a p h a s e c h r o m o s o m e ,i d i o g r a ma n d k a r y o t y p e ,r e s p e c t i v e l y .T h e 5S r D N As i g n a l i s r e d a n d i n d i c a t e db y t h ew h i t e a r r o wi n t h e f i g u r e ;C h r o m o s o m e s a r e d y e db l u ew i t hD A P I ;B a r =10μm744草 地 学 报第32卷表4 3种葱莲属植物的核型特征T a b l e 4 T h ek a r y o t y p e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h r e e Z e p h y r a n yh e s s p e c i e s 名称N a m e核型公式K a r y o t y pe f o r m u l a 相对长度范围R e l a t i v e l e n g t h r a n g e /%最长/最短L o n g e s t /S h o r t e s t 核不对称系数A s y m m e t r y i n d e x /%平均臂比A v e r a g e a r mr a t i o 核型类型K a r y o t y pe L i l y P i e s 2n =2x =24=6m+18s m6.17~12.802.0763.851.832B F r a gr a n c e 2n =2x =24=14m+10s m6.36~12.081.9063.561.812AK i n g's r a m s o n 2n =4x =48=28m+20s m 5.68~13.552.3960.421.602B3 讨论r D N A 是所有真核生物所必须的序列,本研究中的3种葱莲属植物的5Sr D N A 位点均位于染色体的长臂末端,与F e l i x 等[7]分析的7种葱莲属植物的结果一致㊂表明葱莲属植物虽然处于进化活跃的阶段,其5S r D N A 在染色体上的位置分布相对稳定㊂其中5Sr D N A 位点在不同染色体上主要表现为数目和大小的差异,这与前人的相关研究一致[14]㊂从染色体核型角度分析,葱莲属植物具有较丰富的染色体倍性,如Z .c a n d i d a H e r b .体细胞染色体存在多种类型2n =24,26,36,38,39,40,41,42,49[9,15];也有如在Z .r o s e a 中发现体细胞染色体有2n =26,27,28,48等类型[16]㊂在本样本中,所有葱莲属植物的染色体基数x =12,其中 L i l y Pi e s 和 F r a g r a n c e 为二倍体, K i n g 's r a m s o n 为四倍体㊂在最开始的一些研究者认为,葱莲属的染色体基数x =6,并认为染色体基数在整个属中都保持不变[17]㊂然而随着越来越多的葱莲属植物的染色体倍性的报道,本属还存在其他的染色体基数的报道,比如Z .r o s e a 染色体基数有x=9,12,13,14;Z .c a n d i d a H e r b .染色体基数有x=5,7,12,13,19[6,9,15]㊂而就目前所流行的葱莲属栽培品种中其染色体基数多为x =12㊂染色体大小和核型公式是了解一些植物类群的进化和系统发育的重要工具[18-20]㊂葱莲属植物中,染色体数目变化很大,核型不对称性没有显著差异[7,21]㊂本研究的3种葱莲属栽培品种的染色体长度范围在5.68~13.55μm 之间㊂利用臂比值可以得出植物间的核型进化程度,前人的细胞学数据显示葱莲属植物常见的染色体核型大多是由中部着丝粒染色体( m 型)和近中部着丝粒染色体( s m 型)组成,其中 m型染色体占大多数[6,15]㊂在本研究中,同样的也只含有 m 和 s m 型染色体,与前人的结果类似㊂因此,本研究结果支持葱莲属植物核型不对称在核型进化中并不起重要作用的观点[7,21]㊂4 结论本研究中的3种葱莲属栽培品种含有两种倍性,二倍体和四倍体,染色体基数均为x =12㊂它们的5S r D N A 位点均位于染色体的长臂末端,不同品种的位点数有一定的差异㊂参考文献[1] C H OWD HU R Y M R ,HU B S T E N B E R G E RJ .E v a l u a t i o no fc r o s s p o l l i n a t i o no f Z e p h y r a n t h e s a nd H a b r a n t h u s s pe c i e s a n d h y b r i d s [J ].J o u r n a lo ft h e A r k a n s a s A c a d e m y ofS c i e n c e ,2006,60(1):113-118[2] S P U R R I E R M A ,S M I T H G L ,F L A G G R O ,e ta l .A n e ws p e c i e s o f Z e p h yr a n t h e s (A m a r y l l i d a c e a e )f r o m M e x i c o [J ].N o v o n ,2015,24:289-295[3] K A T O C H D ,S I N G H B .P h y t o c h e m i s t r y a n d p h a r m a c o l o g y of g e n u s Z e p h yr a n t h e s [J ].M e 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岩原鲤池塘养殖技术研究作者：冉孟斌来源：《农家致富顾问·下半月》2016年第07期摘要随着人们生活水平的提升，对于优质商品鱼的需求量也在逐渐增加，岩原鲤的市场需求量也越来越大，因此对岩原鲤在规模化养殖技术方面的要求已非常突出。

在生产实践过程中，对于岩原鲤的养殖方式有很多种，可以使用不同的养殖密度进行不同的饲料配对，探索出更高产量和更优品质的养殖模式。

基于此，本文对岩原鲤池塘育种技术进行分析和研究。

关键词岩原鲤池塘养殖岩原鲤属于鲤鱼科目的，也被称为是岩鲤或者是墨鲤。

一般生活在长江中下游或者支流地带中，是一种以栖息在岩石裂缝中生长的一种底层鱼类，一般在嘉陵江或者金沙河中的分布比较多，当前岩原鲤已经成为四川等省份的有名的鱼类。

岩原鲤的特点是肉质白嫩，口感佳，因此市场前景也非常好。

本文主要对岩原鲤池塘育种技术进行分析。

一、岩原鲤池塘养殖的基本情况分析（一）育种实验基本情况岩原鲤的养殖池塘选择在重庆市万州区兴海农业有限公司兴海园区内，面积大约为0.45平方千米，池塘的形状是长方形，阳光比较充足，并且通风性和水源也比较充足，对于实验灌溉有非常大的促进性作用。

池塘水深能保持在1.8米左右的池塘养殖，水质清新。

在岩原鲤实验中，使用自行培育的寸片鱼种。

所选择的饲料也是岩原鲤适用的饲料，能够添加更多的维生素和矿物质元素，含有丰富的蛋白质，蛋白的总量基本超过了40%，可以保障岩原鲤的生长需求。

（二）育种实验设计在育种实验的过程中，一共有两种办法，使用两个岩原鲤养殖池进行养殖。

也使用两种不同的饲料。

第一种，也就是一号岩原鲤养殖池中，面积是0.22平方千米，鱼种规格是三cm每尾，养殖的密度12万尾/平方千米，使用的饲料是40%的鱼粉+20%豆饼+10%菜饼+5%米糠+次粉19%+麸皮4%+粗蛋白38%；第二号岩原鲤养殖池面积在0.23平方千米，鱼种规格也是三cm每尾，养殖的密度15万尾/平方千米，配方饲料使用的是30%鱼粉+18%豆饼+12%菜饼+10%米糠+次粉20%+麸皮9%+粗蛋白33%.二、岩原鲤养殖方法的研究（一）鱼种的放养鱼种放养前池塘使用每平方千米1500千克的生石灰进行消毒，然后经过阳光的暴晒毒性消失以后再进行灌水，池塘水深1.5米，以备使用，并且配备2kw增氧机器，每一个池塘中都放入100尾500克的白鲢鱼，让其发挥调解水质的作用。

fish核型鉴定步骤
样本制备
收集新捕获的活鱼或从冷冻保存组织中取样。

组织样本包括鳍条、鳃丝或血液（取决于物种）。

核酸提取
使用专门的核酸提取试剂盒或标准的酚-氯仿法提取基因组DNA。

DNA 浓度和纯度应通过分光光度法或荧光定量进行评估。

DNA 消化
选择性地用限制性内切酶消化 DNA，产生特定的片段大小分布。

消化条件（温度、时间、缓冲液）根据所选限制性内切酶而优化。

电泳分离
将消化的 DNA 样品加载到琼脂糖凝胶上并进行电泳分离。

DNA 片段根据大小和电荷迁移，形成称为核型的条形图样。

探针标记
制备物种特异性探针，这些探针是经过荧光或放射性标记的DNA 片段。

探针针对特定的染色体区域或基因序列。

杂交
将标记探针与分离的 DNA 片段进行杂交，允许探针与互补序列结合。

结合过程在受控的条件下进行，例如温度和时间。

洗涤和检测
洗涤杂交膜以去除未结合的探针。

检测结合的探针，通常使用荧光成像仪或放射性自显影法。

数据分析
分析杂交信号强度和图案，以确定特定染色体的存在或缺失。

杂交信号强度可以反映染色体拷贝数变化或突变。

结果解读
根据探针定位和杂交模式，确定核型异常。

异常可能包括：
染色体数目的增加或减少（非整倍体）
染色体结构异常（缺失、易位、倒位）
等位基因的丢失或获得（杂合或纯合）
应用
鱼类核型鉴定广泛用于：
繁殖和遗传管理
物种鉴定和进化研究
疾病诊断和治疗
保护和生物多样性研究。

岩原鲤生长激素基因部分cDNA克隆和表达研究的
开题报告
题目：岩原鲤生长激素基因部分cDNA克隆和表达研究
研究内容和意义：
岩原鲤是一种重要的经济鱼类，经常被作为食用鱼和观赏鱼。

它的生长速度和体形大小直接影响着它的市场价值和养殖利润。

因此，研究其生长调控机制，特别是生长激素基因的克隆和表达规律，对于深入了解其生长发育机制，优化饲养管理，提高其养殖效益具有重要意义。

本研究旨在克隆岩原鲤生长激素基因部分cDNA序列，进而进行系统性的表达特征分析。

具体研究内容包括：
1. 通过对我们前期已建立的岩原鲤cDNA文库进行筛选和挑选，获取生长激素基因的部分序列。

2. 利用生物信息学方法对生长激素基因进行序列分析和功能预测。

3. 利用qPCR技术对岩原鲤生长激素基因在不同组织（肝、肌肉、脑、肾等）中的表达情况进行分析。

4. 利用荧光原位杂交技术对生长激素基因在岩原鲤垂体中的表达进行探究。

通过这些实验，我们将能够获取岩原鲤生长激素基因的部分cDNA 序列，并进一步了解其分子结构和生物学特性。

研究结果将为进一步深入研究岩原鲤生长调控机制提供理论基础和实验依据，对资源管理和养殖业的发展具有一定的指导意义。