医学课件实验 一二三四---- DNA重组技术

酶切反应注意事项：
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５ ０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对 内切酶的污染。
ddH2O：
Ⅱ型酶
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切
割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
质粒的应用
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细
菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
本实验目的
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法；
限制酶
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有



修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有 甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特 定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很 难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物 上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组
成，其中Mg2+为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
质粒提取 限制性内切酶酶切
琼脂糖凝胶电泳 胶回收
核酸的体外连接
碱裂解法小量制备质粒DNA
一．实验目的及背景



质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
实验方法
１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中



（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。 ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心 30秒，弃上清 ３．将细菌沉淀悬浮于250μl预冷溶液Ⅰ（已加入 RNA酶）中，振荡混匀。 ４．加入250μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混 匀内容物。 ５．加入350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次。 ６．12000g 离心8 分钟，取上清移到吸附柱中离心 1分钟。
各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
碱变性法基本原理
1. 溶菌酶 2. 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 3. 中和： pH 4.8 醋酸钠
溶菌，释放DNA
蛋白质、DNA变性 中和、质粒DNA复性
碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌
染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再进一步纯化质粒DNA。
７．加入700μl 70%乙醇，１２000g 离心1分钟。 8 . 重复7 9 . １２000g离心2分钟 10．加入50μl 洗脱液至吸附膜中央，１２000g 离
心1分钟。 11．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1% 琼脂糖电泳。 12．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ,
HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需 在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来 定。一般２小时即可充分酶解。
步骤
1. 酶切体系
质粒 10 buffer 15µl体系中 E1 E2 5-8µ l 1.5 µ l 0.25 µ l 0.25 µ l
注意事项Biblioteka 1. 菌浓度，OD值 2. P1充分重悬菌体沉淀 3. P2裂菌时间不超过5min，动作温和。 4. 洗涤后充分离心
ＤＮＡ的酶切
一．实验目的及背景
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ
中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是 从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功 物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷 酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ， ３’端为ＯＨ。
２．ＤＮＡ：
作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯

度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、 EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在 均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。