当前位置：文档之家 › 第4章 抗体制药(三)PPT课件

第4章 抗体制药(三)PPT课件

  • 格式：ppt
  • 大小：3.35 MB
  • 文档页数：39

下载文档原格式

  / 39

合集下载

第四章 抗体制药ppt课件

第四章 抗体制药ppt课件

解决问题的方法或途径——基因工程技术
1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、 单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消 除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗 体分子的1/80～1/3。
第一节 单克隆抗体（Monoclonal Antibody） 的制备
1、单克隆抗体与多克隆抗体
单克隆抗体（McAb ）：如果把能分泌某种特异抗体的 一个B型淋巴细胞分离出来，通过纯种培养，则只产生一种 抗体，可以特异性地与体内一种抗原结合，这种单一的特异 抗体即为单一B细胞克隆抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
2、制备单克隆抗体的一般流程
3、杂交瘤细胞的制备与筛选流程图
BALB/C小鼠
注射矿物油诱发 骨髓瘤细胞 TK或HGBRT缺陷
BALB/C小鼠
注射某种抗原免疫 脾细胞 B淋巴细胞
融合（PEG） 分装于多孔培养板培养（HAT） 亲株死亡
杂交瘤细胞生长繁殖
鉴定单克隆抗体 选出优良杂交瘤细胞， 用于生产或冷冻保藏
二、杂交瘤细胞的制备
1、抗原与动物免疫的获得
免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠
多克隆抗体：动物细胞的免疫系统接受到一个新的抗原 时，并不是对抗原的所有表面都作出反应，而只对抗原中特 异的抗原决定簇产生应答，一般一个抗原有多个抗原决定簇， 可以同时诱导产生多个B型淋巴细胞的增生。机体在同一时间 都是接受多种外界的抗原物质的，使得B型淋巴细胞增生的种 类也有多种，造成不同种B型淋巴细胞同时存在于体液中，由 此产生的抗体也是多种，所以从体液中分离提取的多种抗体 也是由多种B型淋巴细胞产生出来的，是多种抗体的混合物。 由B细胞分裂而形成的细胞群（是同质的），称为一个克隆。 因此存在于体液中各种抗体的总和可称为多种B细胞克隆抗体， 简称多克隆抗体（polyclonal antibody）。

生物技术制药——第四章抗体制药演示文稿

生物技术制药——第四章抗体制药演示文稿
有害物质： 1.直接使抗原失去活性 2.使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏 3.使抗原表面弱化从而易于受补体破坏
第六页，共194页。
免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）
破伤风毒素
第七页，共194页。
免疫球蛋白
抗体分子（antibody,Ab）是由浆细胞合成和分泌的，而每一种
浆细胞克隆可以产生一种特异的抗体分子，所以血清中的抗体是 多种抗体分子的混合物，它们的化学结构是不均一的，而且含量 很少，不易纯化，是抗体分子结构分析的困难。 多发性骨髓瘤是由浆细胞无限增殖形成的细胞克隆，由于所有 瘤细胞的遗传特性相同，因此它们合成和分泌的蛋白质分子在 化学结构上是均一的。这种蛋白分子存在于血液中的称为骨髓瘤
(Kappa/Lambda=1.9±0.36) Kappa/Lambda的比率对于不同类型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值 为2。这个比率也随不同年龄阶段的人群而有所改变，同时有人种和地区差异 。但对于正常人这个比率基本恒定。
在浆细胞瘤中由于一个浆细胞恶性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速发生 变化，比率改变，这可以用来鉴别Kappa型或Lambda型骨髓瘤。
通过二硫键连接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。稳定
分泌型IgA的结构，对抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解 具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。
第三十五页，共194页。
第三十六页，共194页。
免疫球蛋白的水解片段
铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。 木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成
分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc 片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片 段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。 Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结晶， 故称为可结晶片段（Fc）。

抗体制药ppt课件

抗体制药ppt课件

RPMI1640培养液
成分 含量 RPMI1640粉 10.4g HEPES 2.4g L-谷氨酰胺 0.3g 青霉素、链霉素 各10万U 水 1000ml pH=7.4，过滤、除菌
第二节 单克隆抗体 ——筛选阳性克隆与克隆化
1、筛选 • 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 2、克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获 得细胞集团的整个培养过程。 • 有限稀释法：HT培养液/饲养细胞 • 软琼脂法：0.5%琼脂糖凝胶/易成功
抗体制药
第一节 概述
•
1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒
素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。
•
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为
白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性
主要存在于γ球蛋白组分。
第一节 概述
•
抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原 特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激 后，B淋巴细胞被活化增殖、分化为浆 细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 即B细胞→浆细胞→球蛋白
第二节 单克隆抗体 ——杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1、染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分 泌抗体的能力。数目多、集中（稳定高效 价） 2、McAb的Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不 同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴 定。 3、亲和力测定 4、特异性、纯度、识别抗的大量制备
•
针对一个抗原决定簇、单一B细胞克隆产生、 结构和特异性完全相同、高纯度。
抗 原 小鼠/大鼠 脾 脏
淋巴细胞 骨髓瘤细胞
多 克 隆
B淋巴细胞 单克隆
第二节 单克隆抗体——抗原与动物免疫
1、制备抗原→动物免疫

《抗体工程制药》课件

《抗体工程制药》课件
新型抗体药物的出现
随着抗体工程技术的发展，新型抗体药物不断涌现，如双特异性抗 体、抗体融合蛋白等。
抗体药物的生产技术的发展
随着生物技术的不断发展，抗体药物的生产技术也不断改进，如细 胞培养技术的优化、基因工程技术的应用等。
抗体工程制药的未来研究方向
新型抗体的研究与开发
研究新型抗体的结构和功能，开发具有新作用机制的抗体药物。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体展示肽库筛选特异 性抗体的技术。
该技术将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外 源基因编码的肽段在噬菌体外壳上展示，然后通过筛
选噬菌体展示肽库来获得特异性抗体。
噬菌体展示技术具有筛选效率高、特异性强等优点， 为抗体药物的研究和开发提供了新的工具。
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术是通过改变蛋白 质的氨基酸序列和结构来改变其
功能的一种技术。
在抗体工程制药中，蛋白质工程 技术可用于优化抗体分子的结构 和功能，提高抗体的亲和力和稳
定性，降低免疫原性。
蛋白质工程技术为抗体药物的研 发提供了强有力的手段，有助于 推动抗体工程制药领域的发展。
03 抗体药物的药效学研究
CHAPTER
抗体药物的生产技术研究
优化抗体药物的生产工艺，降低生产成本，提高产量和质量。
抗体药物的免疫原性研究
研究抗体药物的免疫原性机制，寻找降低免疫原性的新方法。
谢谢
THANKS
抗体药物的药效学研究进展
1 2 3
新型抗体药物的开发
随着抗体工程技术的发展，越来越多的新型抗体 药物被开发出来，如人源化抗体、单域抗体、双 特异性抗体等。
抗体药物的疗效和安全性
随着临床试验的深入开展，抗体药物的疗效和安 全性得到进一步验证，为抗体药物的应用提供了 更可靠的依据。

第四章抗体制药part课件3

第四章抗体制药part课件3

第六节 抗体诊断试剂
C、诊断方法：RPHA（reverse passive hemagglutination），反向被动血凝反应）法。
在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，许多血细胞 沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块 状。
第六节 抗体诊断试剂
⑶ 妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血清和尿液中的HCG
第五节 抗体工程
噬菌体抗体库技术的优势
• 可实现单抗的小型化 • 可实现单抗的多功能化 • 简单易行、生产成本低、筛选容量大、
可通过发酵生产、大量制备
第五节 抗体工程
单克隆抗体
杂交瘤技术
宿主细胞
杂交瘤
筛选范围
~103
时间
几个月
操作
繁杂
免疫
必须
人源抗体
—
费用
高
生产量
有限
基因获取
再克隆
应用前景
有限
噬菌体抗体 展示技术
基因型和表型相统一 选择能力和扩增能力相结合
第五节 抗体工程
噬菌体展示技术最关键的优势有三： 第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选 到高亲和力噬菌体成为可能； 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通 过感染细菌得到富集； 第三，展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的 基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既 快速又简便。
件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具 有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异 性结合而使血细胞发生凝集。
B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠----获得抗HBs血 清----硫酸铵盐析/柱层析----取其lgG----在pH4.0醋酸缓冲 液中致敏醛化血细胞----洗去多余蛋白成分，用含1%兔血 清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。

抗体制药最新PPT课件

抗体制药最新PPT课件

第三节 杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1. 抗原 凡是能具有抗原性质的物质均可制备单 克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位 或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、 脂类等
用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲， 纯度要求就可以不高，也可以使混合抗 原
2. 免疫
动物的选择 目 前 常 用 的 骨 髓 瘤 细 胞 系 来 自 BALB/c 小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 体内免疫法 B. 脾内免疫法 C. 体外免疫法
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
二、杂交瘤及杂交瘤技术
细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合 或是在诱导物的作用下不同细胞间的融 合 淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞 形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞 通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于 某些细胞特性的研究和生产所期望的免 疫分子，称为杂交瘤技术
二、 骨髓瘤细胞的选择
在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多 发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细 胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分 泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表 达自身抗体或部分表达 常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1， Y3，YB2
三、 免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏， 研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎 红细胞后，洗涤并调整到（1～5）X107 个／ml浓度备用
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1. 杂交瘤细胞的克隆化
2. 杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1. 动物体内诱生法
2. 体外培养法
八、单克隆抗体生产的一般流程

生物化学4抗体制药ppt课件


2. Fv与单链抗体（single chain Fv，ScFv ）
（1）Fv （可变区片断）
VL、VH非共价键结合（单价） 完整抗体的1/6 基因工程重组生产 易解离
（2）ScFv
常用连接肽：(Gly4Ser)3
优点： • 分子量小（1/6），免疫原性低 • 容易进入瘤体组织 • 无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低 • 单链容易改造 • 可采用大肠杆菌大量生产
骨髓瘤细胞： 自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。 HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）
融合过程： 取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）
进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在 2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。
HAT选择性培养基培养
动物细胞核苷酸合成两条途径：
全合成途径、补救合成途径
氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和 二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结 合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻 断了阻断GMP、TMP的生物合成。
GMP、TMP的补救合成途径：
离心或过滤
IgG
亲和层析
超滤
4.3 基因工程抗体
互补性决定区 (CDR， complementar ity determinant region) 骨架区（FR, frame region）
Vk1
一、嵌合抗体（chimeric antibody）
将鼠源单克隆抗体 可变区和人抗体恒定区 连接起来的抗体。
根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法： • 体外诊断试剂IgG类-----沉淀处理+亲和层析 • IgM类------沉淀处理+凝胶过滤 • 体内诊断试剂或治疗用药-----亲和层析+阴离子交换层析
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

放射免疫（竞争法）
结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）
第六节 抗体诊断试剂
三、导向诊断药物
在体内直接诊断病原的抗体试剂被称为导向诊断药 物。
放射免疫显像定位技术是把特异性与病原细胞表面 抗原结合的抗体预先同重金属络合剂—二乙基三胺 五乙酸 (DTPA)耦联成Ab-DTPA，注入体内，“自动 寻的”与病原细胞结合；再注入In-113M（放射性核 素，铟），使其与DTPA络合。
（1）诊断试剂的制备：用HBsAg免疫豚鼠，获得抗 HBs血清，实质是含HBsAg抗体（HBsAb）的血清； 甲醛处理红细胞，与抗HBs血清混合，红细胞大量 吸附血清中的包括HBsAb在内的蛋白。待测样品 中有HBsAg时，发生凝聚。
（2）RPHA法测定HBsAg通常在V型血凝板上进行， 操作时应附有阴性、阳性和空白对照。
第六节 抗体诊断试剂
二、免疫标记用的抗体试剂
为了提高诊断的灵敏度，用放射性同位素、荧光 素或酶对抗体做标记，放大抗体—抗原反应的表象， 是免疫标记诊断的实质内容。
结合显微镜或电子显微镜技术，还能对抗原物质 作出组织内或细胞内的定位测定，除了诊断外，还 能为探讨发病机制提供有力的研究手段。
（一）荧光抗体诊断试剂
第六节 抗体诊断试剂
抗体诊断的理论基础是抗体与抗原之间 的特异性反应。 在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬 和中和毒素等作用。 在血清学检验中，表现为凝聚。
免疫学的迅速发展使诊断技术不断更新，抗体用于 诊断，体现在三类诊断药物中： ① 血清学诊断中使用的抗体制剂 (体外诊断) ② 免疫标记用的抗体制剂 (体外诊断) ③ 体内导向诊断的抗体药物 (体内诊断)
优点：特异性高；缺点：每种抗原须单独制 备相应的荧光抗体。 （2）简接法：用荧光标记抗球蛋白抗体（荧光 第二抗体）来检测未知抗原。只需制备一种 荧光标记的抗体，即可用以检测多种抗原抗 体系统，敏感度比直接法高5～10倍。
免疫荧光（神经元） 免疫荧光显像系统
（二）免疫酶抗体诊断试剂
用酶标记来检测抗原，分为免疫酶染色（组比法） 和酶免疫测定两种类型。
放射免疫显像定位技术通过放射自显影，可以对病 原细胞 (如肿瘤)进行组织定位、显示肿瘤细胞转移 形成的病灶、观察抗体在血液中的功能半衰期、确 定肌体对抗体做出的不良反应等。
（2）诊断血清的制备：用病菌抗原免疫 动物，采血、离心分离得到血清。
（3）诊断方法：直接凝集反应，常用玻 片做定性试验，简便快速。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体试剂
2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的 反向被动血凝诊断试剂
用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原，称 为反向被动血凝试验(RPHA)。
➢ 该法特异性强、结合稳定，在与抗体、酶、 荧光素等结合后不影响后者的生物活性， 可用于检测多种抗原抗体系统。
➢ 灵敏度：扩散试验 < 电泳试验 < 凝集试 验 < ELISA < BAS-ELISA、放射免疫分析 试验。
（三）放射免疫用抗体诊断试剂
放射免疫技术：
灵敏度最高的检测手段。诊断试剂设计中考虑的 是用放射性同位素131I和125I标记抗体，放射自显影 检测。 把同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性 两大特点结合起来。 在医学实践中可用放射性自显影法检测微量抗原物 质。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体试剂
3. 妊娠诊断试剂
孕期三个月的妇女血液和尿液中的人绒毛膜促性腺激 素(human chorionic gonadotrophin, HCG)处于高峰值。
测定体液中HGG的方法常用生物试验法、胶乳间接凝 集试验法、酶联免疫吸附测定法和放射免疫测定法等。
免疫酶染色法用酶标记抗体，称为酶标抗体。测定 时酶标抗体与抗原发生特异性结合，发生组化反应， 产生有色物质，可在光学显微镜下直接观察。
常用辣根过氧化物酶 (horseradish peiroxidase， HRP)标记抗体，加入酶底物－二氨基联苯胺 (diaminobenzidine, DAB)。如果抗体与抗原结合， 底物将被分解，呈现棕褐色。
（1）用胶乳试剂测定HGG：①间接凝集法（不发生凝 集为阳性结果）；②直接凝集法（发生凝集为阳性 结果）
（2）胶乳的致敏方法：①物理吸附法；②化学交联法。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体试剂
4. 抗ABO血型系统血清
血型有多个系统，其中最重要的是ABO血型系统， 按人红细胞表面带有的A或B种凝集原来分型。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未 知的抗原型，主要用于疾病的病原菌 诊断和血型鉴定。
常用的方法是凝集。 优点：简单快速，应用广泛，普及至
基层。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体试剂
1. 鉴定病原菌的抗体试剂（诊断血清）
（1）常用诊断血清的品种和用途 诊断病原菌或相关抗原的试剂包括各种 诊断血清、分群血清、分型血清、因子 血清等。
酶联免疫反应示意 酶标仪
间接法：用于检测血清中抗体 载体抗原＋ 抗体（待检血清）＋酶标抗抗体＋底物-→显色反应
夹心法：检测标本中抗原 载体抗体 ＋抗原（待检标本）＋ 酶标抗体（特异性）＋底物-→显色反应
ELASA（竞争法）
生物素-酶标抗生素蛋白系统抗体诊断试剂 （BAS-ELISA）
➢ 生物素-抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物 可作为一种指示剂，组成一个新的生物放 大系统。
免疫荧光技术：
用异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)、罗丹明 (Rhodamine)或藻红素等荧光色 素标记抗体，直接向组织切片或细胞悬液滴 染，在荧光显微镜下或用流式分光光度计 （流式细胞仪）观察。
1. 荧光抗体的制备
2. 免疫荧光测定方法 （1）直接法：内微量 待检抗原物质的定量测定方法。
➢ 酶联免疫吸附技术：ELISA 酶免疫测定在方法上的一个重大改进，
使抗原或抗体吸附在聚苯乙烯塑料等表面 上进行反应，大大简化了抗原抗体结合物 的分离过程。
用途广泛，敏感度高，既可定性也可 定量。
酶联免疫吸附试验――ELISA