生物化学实验指导手册

实验一、考马斯亮蓝G-250【实验目的】学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。

染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。

本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。

【实验材料、仪器及试剂】1．材料：新鲜的植物材料2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml（2）考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。

在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。

2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。

将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。

【结果计算】C × V T样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝V S×W F×1000式中：C为查标准曲线值（ug）；V T为提取液总体积（ml）；V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）。

实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定【实验目的】学习掌握鲜材料中游离氨基酸含量测定的原理和方法。

【实验原理】当氨基酸与水合茚三酮共热时，能定量地生成酮茚胺。

该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。

其最大吸收值在570nm ，并在一定范围内与氨基酸含量成正比。

氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。

【实验材料，仪器及试剂】1．材料：新鲜的植物材料2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3．试剂：（1）水合茚三酮试剂（2）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）（3）标准亮氨酸标准液∶含氮为5ug/ml （4）0.3%抗坏血酸溶液：【实验步骤】1．样品提取∶取新鲜植物样品0.5-1g，加5ml 10%醋酸研磨，离心取上清液0.5ml，用pH5.4醋酸盐缓冲液，定容至25ml。

2．标准曲线的绘制：取6支20ml刻度试管，按下表进行操作。

加完试剂后混匀，在沸水中煮 5分钟，然后在冷水中冷却、摇匀，稀释到20毫升。

用1cm 光径比色杯在570nm下测定吸光度，绘制标准曲线，根据样品吸光值在标准曲线查得氨基态氮含量。

【结果计算】C×V T100克样品中氨基态氮含量＝×100V S×W F式中∶C为从标准曲线上查得的氨基态氮含量(ug)；V T为提取液总体积（ml）；V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）实验三酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响（一）酶的特异性【实验原理】酶具有高度的特异性，一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物，如淀粉酶，只能催化淀粉水解，而不能使蔗糖水解。

本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用，来说明酶的特异性。

【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。

2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液3．0.5%蔗糖液4．Benedict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3（无水）100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。

（可长期保存）。

【实验步骤】1．取试管两支，一支加入0.5%淀粉液2mL，另一支加入0.5%蔗糖液2mL；2．于两支试管中各加入制备好的唾液1mL；3．将两支试管同时放入37℃恒温水浴箱中保温；4．15分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；5．将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；6．取出两试管，观察记录颜色的变化，并注意有无红色沉淀产生，为什么？（二）温度对酶活性的影响【实验原理】酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行，使酶促反应速度最大时的温度称为此酶的最适温度，低于此温度，酶促反应速度缓慢，高于最适温度，酶蛋白变性失活。

本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例，说明温度对酶活性的影响。

【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。

2．0.3%NaCl的0.5%淀粉液3．KI-I溶液【实验步骤】1．取三支试管并编号，同时各加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；2．将管1、管2、管3同时分别放入冰浴，37℃水浴，沸水浴中；3．15分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化，并解释此现象。

（三）pH对酶活性的影响【实验原理】在一定条件下，酶活性最高时的pH值称为最适pH，偏离此pH，酶活性就会有所下降，不同酶的最适pH不同。

例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。

本实验以入唾液淀粉酶（最适pH6.8）在不同pH条件下水解淀粉为例，说明pH对酶活性的影响。

【实验试剂】1．唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。

2．pH1.5溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；2．pH6.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸溶液18.2mL；3．pH9.8溶液：取0.2M Na2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸溶液2.2mL，然后用0.1N NaOH 调至pH9.8。

【实验步骤】1．取试管3支并编号，如下表加入各试剂；2．3支试管同时放入37℃恒温水浴箱内保温；3．15分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加1滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。

实验四淀粉酶活性的测定【实验目的】本实验的目的在于掌握分别测定这两种淀粉酶的方法。

【实验原理】淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5—二硝基水杨酸试剂测定。

由于麦芽糖能将3，5—二硝基水杨酸还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。

以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。

【实验材料、仪器和试剂】1．实验材料：萌发的小麦（芽长1厘米左右）2. 仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3. 试剂：1％淀粉溶液，0.4N N a O H，，PH5.6的柠檬酸缓冲液，3，5一二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，【操作步骤】1. 酶液的提取：称取2克萌发的小麦种子（芽长1厘米左右）,置研钵中加一克石英砂，磨成匀浆倒入50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心6000转/分钟，取上清液备用。

2. a-及β-淀粉酶总活性的测定：取上述酶液2～6毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升（稀释程度视酶活性大小而定）。

混合均匀后，取4支试管，2支为对照,2支为测定管，各加入稀释之酶液1毫升及1毫升Ph5.6之柠檬酸缓冲液。

以下步骤重复a-淀粉酶测定的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。

3. 酶促反应液的制备：取4只试管标号，按下表加入试剂: （反应时间要准确！！！）4. 标准麦芽糖及酶水解液中麦芽糖含量的测定；按下表加入试剂将上表中试剂加完后，充分混匀，放入沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520um波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线；将酶水解液测定的消光值在麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。

【结果与计算】（a+β）-淀粉酶总活性[麦芽糖（毫克）/鲜重（克）/ 分钟]= （B-B’）×样品稀释总体积样品重（克）×CB一(a+β)-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量B一(a+β)-淀粉酶的对照管中麦芽糖量C一比色时所用样品液毫升数实验五植物材料中维生素C含量的测定（染料滴定法）【实验目的】本实验要求学生掌握染料滴定法测定维生素C的原理和方法【实验原理】维生素C在体内是一种较强的还原剂，利用染料2，6-二氯酚靛酚作氧化剂，可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身还原成无色的衍生物。

2，6-二氯酚靛酚在酸性条件下呈红色。

在滴定终点之前，滴下的2，6-二氯靛酚立即被还原成无色。

当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。

【实验材料、仪器和试剂】1．实验材料：水果或蔬菜2．仪器：天平，微量滴定管，研钵，容量瓶，移液管，三角瓶，漏斗3．试剂：（1）2%草酸（2）0.001N2，6-二氯酚靛酚钠溶液【操作步骤】1．样品的处理和提取：称取4.0克新鲜样品，置研钵中，加5毫升2%草酸，研成匀浆。

通过漏斗将样品提取液转移到50毫升时瓶中。

残渣再用2%草酸提取2～3次，提取液及残渣一并转入量瓶中最后以2%草酸定容。

摇匀，过滤，滤液待测。

2．空白、样品的测定：吸取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定到出现明显的粉红色在15秒内不消失为止。

记录所用滴定液体积。

（再重复二次）3．测定：取2%草酸10毫升，放入别一50毫升三角瓶内，用2，6-二氯酚靛酚钠滴定到终点，记录染料用量。

（平行两份）【结果与计算】（V1－V2）×K×VX= ————————————×100W×V3式中：X：100克样品所含维生素C毫克数（毫克/100克）W：称取样品重（克）V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）V：样品提取液稀释之总体积（即50毫升）K：1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出。

实验六血红蛋白凝胶过滤层析【实验目的】通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术，掌握凝胶过滤层析的原理及其应用。

【实验原理】凝胶过滤（gel filtration）是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析（molecularsieve chromatography）或排阻层析（exclusion chromatography）。