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副溶血性弧菌食物中毒诊断技术*导读：副溶血弧菌营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。
在含盐3.5%的培养基上生长良好，0.5%盐时可生长，12%以上及无盐的培养基中不能生长。
……(一)检验方法1.样品采集以无菌方法采取具代表性的样品，置灭菌的容器内。
一般采集患者粪便、呕吐物和中毒的可疑原因食品。
常见可疑的食品有鱼、虾、蟹、贝等海产品及其他有关的食品。
若上述食品均为煮熟品，也可检验它们的包装物、烹调用具等。
副溶血弧菌不宜在低温环境中生存，故采集到的样品应尽快送往实验室，不宜冷冻保存运送，以免影响检验结果。
2.分离培养副溶血弧菌营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。
在含盐3.5%的培养基上生长良好，0.5%盐时可生长，12%以上及无盐的培养基中不能生长。
发育温度为30-37~C，以37~C最佳。
生长的pH范围是7.0-9.5，最适pH为7.7～8.0，需氧性强，厌氧生长很缓慢。
多数菌株于肉汤、蛋白胨水等培养基中呈浑浊表面形成菌膜。
R型菌发生沉淀。
厌氧培养48h以上，才见生长。
固体培养基上菌落常呈圆形隆起，不透明，表面光滑、湿润，多数菌株继代后，呈不正圆。
粗糙型菌落，灰白半透明或不透明，在EMB琼脂上不生长。
某些菌株在麦康凯培养基上不生长;生长者，其菌落为圆形、平坦、半透明或浑浊略带红色。
从腹泻病例初次分离到的菌落多较典型一般不形成色素。
食品中分离到的菌株，多为R型。
胆酸盐稍有阻止该菌扩散的作用，血平板上可见溶血环。
在氯化钠蔗糖平板上菌落呈绿色。
S.S琼脂上菌落中等大，无色透明、扁平、有动性，不易被接种环挑起。
该菌对乙酸，90%以上菌株对0/129抑制弧2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶)敏感。
该菌的溶血作用是因其具有耐热性溶血素，这种溶血素是相对分子质量约为42000的酸性蛋白质，对心脏有毒性，是一种即时型致死毒。
(二)动物试验经上述试验符合副溶血性弧菌的菌株接种于3.5%NaCl蛋白胨水中，经16-18h培养后，小鼠腹腔注射0.3ml，观察2-3天。
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
`B66食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法连云港市产品质量监督检验所 发布DB32/TDB32/T -2010前言本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人：周翔本标准于2010年8月首次发布。
食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法1 范围本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 10 CFU/g2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 20001.4-2001 标准编写规定实验原理荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。
必须制成镜检标本。
作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。
夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。
3 设备3.1 拍打式均质器。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min）3.4 全自动加液器（10~1000μl）3.5 天平（0.1g）3.6 直落式荧光显微镜3.7 水套式培养箱3.8 冰箱（0~8℃）3.9 湿盒3.10 20ml一次性注射器3.11 无荧光盖玻片3.12 无荧光载玻片3.13 洗片缸3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）3.15 高压灭菌器4 试剂4.1 副溶血型弧菌羊抗血清4.2 兔抗羊荧光抗血清4.3 甲醇4.4 无荧光丙三醇（甘油）4.5 PBS缓冲液4.6 无菌高纯蒸馏水（无荧光）4.7 次氯酸钠消毒液4.8 封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份5 样品制备5.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。
食品微生物学检验副溶血性弧菌检验（三）6.1 制备接种两管3%试管斜面，36℃±1℃培养18h～24h。
用含3%的5%溶液冲洗3%斜面培养物，获得深厚的菌悬液。
6.2 K抗原的鉴定取一管6.1制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清举行检测，浮现凝集反应时再用单个的抗血清举行检测。
用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对比间隔。
在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。
在对比间隔内加一滴3%氯化钠溶液。
轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1min。
阳性凝集反应可以立刻观看到。
6.3 O抗原的鉴定将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121℃灭菌1h。
灭菌后4000r/mιn离心15min,弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4000min离心15min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。
用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。
在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分离加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自疑对比。
轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1mm。
阳性凝集反应可以立刻观看到。
假如未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121℃再次高压1h后，重新检测。
假如仍为阴性，则培养物的O抗原属于未知。
按照表1报告血清学分型结果。
表1副溶血性弧菌的抗原 7 神奈川实验(选做项目) 神奈川实验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。
神奈川实验阳性结果与副溶血性弧菌分别株的致病性显著相关。
用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板。
每个平板上可以环状点种几个菌。
36℃±1℃培养不超过24h,并立刻观看。
阳性结果为菌落周围呈半透亮环的β溶血。
8 结果与报告按照检出的可疑菌落生化性状，报告25g(mL)样品中检出副溶血性弧菌。
假如举行定量检测，按照证明为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数(MPN)检索表，报告每g(mL)副溶血性弧菌的MPN值。
副溶血性弧菌检测微生物国标检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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MM_FS_CNJ_01出口食品副溶血性弧菌微生物法MM_FS_CNJ_0148出口食品副溶血性弧菌检验方法1. 适用范围本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。
2. 主要试剂和仪器. 主要试剂30g/L 氯化钠稀释液：见；60g/L 氯化钠蛋白胨水(PW):见；氯化钠多粘菌素B肉汤(SPB):见；硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS):见；氯化钠三糖铁琼脂(TSI) :见；嗜盐性试验用胰胨水(TB):见；胰胨大豆琼脂斜面(TSA):见；靛基质试验用培养基(I) :见；氨基酸试验用培养基:见；V-P 半固体琼脂(VP):见；糖类分解试验用培养基:见；42 C生长试验用培养基：见；O/F 试验用培养基(HLGB):见；神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA):见。
. 仪器试管：17mm< 170mm 15mM 150mm 10mM 100mm 吸管: 1mL、10mL；培养皿:直径90mm；广口瓶或三角瓶；电动均质器；电动试管振荡器；37 C恒温箱；42 C恒温水浴箱；试管架。
3. 样品制备.冷冻样品应在45C以下不超过15min或在2〜5C不超过18h解冻。
若不能及时检验，应放于-15C左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6〜10C冰箱保存，在24h内检验。
. 取样:以无菌操作进行。
鱼类:取鱼体不同部位。
贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。
. 以无菌操作称取50g 检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。
.加30g/L氯化钠稀释水450mL均质(8 000r/min)1min，使成1 : 10稀释液(如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1 : 10稀释液，并充分振荡）。
.用1mL灭菌吸管吸取1 : 10稀释液1mL注入装有9mL 30g/L氯化钠稀释水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1 : 100稀释液。
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法主要有以下几种：
1. 细菌培养：将样品（如血液、粪便等）在适当的培养基上进行培养，副溶血性弧菌会在适宜条件下生长繁殖，通过观察菌落形态和生理生化特性来鉴定是否存在副溶血性弧菌。
2. PCR检测：利用聚合酶链反应（PCR）方法，通过扩增副溶血性弧菌特异性基因片段，进行定性和定量检测。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性。
3. 免疫学检测：利用副溶血性弧菌的特异性抗原与抗体的结合反应来进行检测。
常见的方法有免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
4. 纳米粒子检测：利用特定的纳米粒子与副溶血性弧菌的抗原或DNA结合，形成可见颜色或光信号，通过肉眼观察或仪器读取来检测副溶血性弧菌。
需要注意的是，不同检测方法的适用场景和准确性有所差异，因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的检测方法。
实验八、海产品中副溶血性弧菌检验［实验目的］：1、了解海产品的检样处理方法。
2、学习副溶血性弧菌的检验方法和步骤。
3、掌握副溶血性弧菌常用的生化鉴定方法。
［检验程序］：［操作步骤］：1、无菌操作取鱼背肌肉置无菌平皿内。
检样处理——2、称取鱼肉25ｇ于无菌研钵内研碎（可加适量的海砂）3、将研碎的鱼肉置含225ml、3.5%Nacl的无菌水内，混匀检样。
增菌——取10 ml检样匀液于100 ml氯化钠结晶紫增菌液中，37℃培养8-16ｈ。
选择性平板——将增菌液划线接种氯化钠结晶子紫平板和嗜盐性平板，37℃培养。
生化试验——挑取可疑菌落接种氯化钠三糖铁琼脂，嗜沿盐性试验（0%、7%、10%），甲基红、吲哚、动力、硝酸盐还原、氧化酶、过氧化氢酶。
动物接种试验——［结果记录］：1、记录氯化钠蔗糖平板，嗜盐性平板分裂结果。
2、记录各项生化试验结果。
3、记录动物接种试验结果。
［报告检验结果］：［思考题］：1、在氯化钠蔗糖平板上怎样区分副溶血性弧菌与溶藻弧菌。
2、在3.5%氯化钠三糖铁上、副溶与溶藻表现如何？请分析原因。
3、副溶菌生化试验需要有哪几项？试述各项生化试验原理。
五、副溶血性弧菌实验准备四人一组用品：1、每组一条海黄鱼或海虾，约200ｇ。
2、无菌研钵一只（另配无菌海砂）。
3、225ml、3.5%氯化钠无菌水一瓶。
4、100ml广口瓶结晶紫氯化钠增菌液一瓶。
各组配制培养基、稀释液用品：1、配制容器——量筒、锅、烧杯、10ml吸管、1N NaoH2、分装容器——①平皿40块（氯化钠蔗糖）②平皿40块（嗜盐性）③中号试管50支（三糖铁）④小号试管40支（甲基红）⑤小号试管40支（吲哚）⑥小号试管80支（0% 3.5%）⑦小号试管80支（7% 10%）⑧小号试管40支（半固体）3、牛皮纸、捆扎线、棉塞药品：1-2组蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、蔗糖、琼脂3-4组磷酸氢二钾、多胨、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、琼脂、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠5-6组蛋白胨、氯化钠7-8组蛋白胨、氯化钠、牛肉膏、琼脂其它：氧化酶、过氧化氢酶试纸条、硝酸盐还原——微量生化管0.2%溴麝香草焚蓝0.01%结晶紫0.2%酚红。
