下载文档原格式
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
`B66食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法连云港市产品质量监督检验所 发布DB32/TDB32/T -2010前言本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人：周翔本标准于2010年8月首次发布。
食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法1 范围本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 10 CFU/g2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 20001.4-2001 标准编写规定实验原理荧光抗体染色是荧光显微镜标本上的抗原—抗体反应和荧光结合第二抗体反应。
必须制成镜检标本。
作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。
夹心法，即用未标记的特异性抗原加在玻片上先与菌体中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而在荧光激发下间接地显示出菌体中抗体的存在。
3 设备3.1 拍打式均质器。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min）3.4 全自动加液器（10~1000μl）3.5 天平（0.1g）3.6 直落式荧光显微镜3.7 水套式培养箱3.8 冰箱（0~8℃）3.9 湿盒3.10 20ml一次性注射器3.11 无荧光盖玻片3.12 无荧光载玻片3.13 洗片缸3.14 标本缸（存放实验片待灭菌）3.15 高压灭菌器4 试剂4.1 副溶血型弧菌羊抗血清4.2 兔抗羊荧光抗血清4.3 甲醇4.4 无荧光丙三醇（甘油）4.5 PBS缓冲液4.6 无菌高纯蒸馏水（无荧光）4.7 次氯酸钠消毒液4.8 封片甘油：无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份5 样品制备5.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18 h解冻。
作业指导书O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S副溶血性弧菌的测定编号：XZJY070-00-2019版本：第一版第0次修改编制：审核：批准：实施日期：2019.06.23一、编制目的为规范单位对副溶血性弧菌检测的操作，编制本作业指导书。
二、适用范围本指导书适用于食品中副溶血性弧菌的测定。
三、编制依据GB 4789.7-2013 《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》。
四、检验4.l 设备和材料4.1.1 冰箱：2℃～5℃；4.1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃；4.1.3均质器；4.1.4振荡器；4.1.5 电子天平：感量0.1g；4.1.6 无菌锥形瓶：容量500ml，250ml；4.1.7无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；4.1.8无菌培养皿：直径90mm；4.1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm；4.1.10 无菌毛细管；4.1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸；4.1.12全自动微生物生化鉴定系统。
4.2 培养基和试剂4.2.1 3%氯化钠碱性蛋白胨水；4.2.2 TCBS琼脂；4.2.3 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂；4.2.4 3%氯化钠三糖铁琼脂；4.2.5 弧菌显色培养基；4.2.6 3%氯化钠溶液；4.2.7我妻氏血琼脂；4.2.8氧化酶试剂；4.2.9革兰氏染色液；4.2.10 ONPG试剂；4.2.11 V-P试剂；4.2.12生化鉴定试剂盒。
4.3检验程序检样4.4操作步骤4.4.1样品制备称取25g（ml）样品放入盛有225ml3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，以8000r/min～10000 r/min均质1 min～2min；或置于盛有225ml3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2min，若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。
副溶血性弧菌标准的检验方法副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
