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谷氨酸摇瓶发酵班级：生物工程***姓名：*****学号：200900*****指导老师：黄**摘要谷氨酸主要用来生产味精，是索逊1856年发现的。
谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（EMP途径）、戊糖磷酸途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）。
现在谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。
影响谷氨酸发酵过程的参数有很多，谷氨酸发酵过程主要受种子质量，培养基组成，温度，pH以及供氧速率等因素控制。
关键词：谷氨酸，发酵，生物合成途径，生产菌种，影响因素。
AbstractMost of the Glutamic acid is used to produce aginomoto.It was discovered by Sorson in 1856. Glycolytic pathway,pentose phosphat epathway,tricarboxylic acid cycle,glyoxylate cycle and pyruvate carboxylase branch are included in the pathway of biosynthesis of glutamic acid.Presently Corynebacterium，Brevibacterium，Microbacterium and Arthrobacterium are used to produced Glutamic . microorganism.The state of glutamic fermentation depends on many parameters and variables，e.g，the quality of seeds ，mediumcomposition，temperature of fermentation，pH of broth and supply rate of oxygen.Key word：glutamic，fermentation，biosynthetic pathway，producing strains，influencing factors.前沿谷氨酸是氨基酸的一种，主要用于生产谷氨酸钠，即味精。
谷氨酸摇瓶补料发酵班级：生物工程091班姓名：XXX学号：XXXXXXXXXXXXX指导老师：XX谷氨酸摇瓶补料发酵摘要：本实验以天津短杆菌为菌种，在不同培养基条件下研究摇瓶补料发酵生产谷氨酸。
试验中以OD值检测天津短杆菌的生长状况，以残糖量和谷氨酸生成量控制补料情况。
实验结果表明：在相同培养条件（培养温度32℃，培养箱转速240rpm）下，蛋白胨培养基最高产酸为19g/L，玉米浆70%梯度培养基的最高产酸量为12g/L，根据以上结果可以看出，蛋白胨培养基的产酸量高于梯度培养基。
关键词：谷氨酸补料发酵 OD值残糖量生物素前言：1866年德国H.ittthausen用硫酸水解小麦面粉，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材将它命名为谷氨酸。
1872年Hasiwitz 和Habermaan用酪蛋白水解也制得谷氨酸。
1908年日本池田菊苗在探讨海带汁鲜味时，提取了谷氨酸，开始制造“味之素”。
1901年日本味之素公司用水解面筋法生产谷氨酸。
1936年美国从甜菜废液（斯蒂芬废液）中提取谷氨酸。
1954年多田、中山两人报告了采用微生物直接发酵谷氨酸的研究。
直到1956年日本协和发酵公司的木下祝郎分离选育出一种新的细菌——谷氨酸棒状杆菌，能同化利用100g葡萄糖，可直接发酵并积累40g以上的谷氨酸。
随后进行了工业化研究，自1957年起发酵法制取味精，正式商业化生产。
20世纪60年代后，世界各国也兴起发酵法生产味精，以甘蔗或甜菜、糖蜜、淀粉、醋酸、乙醇为原料，由于石油价格上涨和石油制品的安全性，相继改用糖蜜、淀粉原料为主的发酵法生产味精。
谷氨酸发酵机制：谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径、HMP 途径、TCA循环、乙醛酸循环、CO2固定反应。
总反应途径为：糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。
一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA 循环，由三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。
题目谷氨酸生产菌的代谢机理和研究现状谷氨酸(Glutamic acid)，是人体非必须氨基酸。
里索逊于1856年发现谷氨酸，至今已成为世界上氨基酸产量最大的品种。
其用途非常广泛，尤其是其下游产品的开发应用。
食品行业主要用于味精，增鲜剂的生产，还可与其他氨基酸并用增强功能；医药行业，多用于预防和治疗肝性昏迷，保护肝脏，是肝病患者的辅助药物。
而谷氨酸在改善儿童智力发育，维持大脑机能，治疗脑震荡或神经损伤等都有一定疗效；在日常用品中，洗发水、生发剂、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等都可以见到谷氨酸的踪影；农业，谷氨酸还可以用于柑桔增甜剂、微肥的载体、杀菌剂（氨基酸铜）。
1 谷氨酸发酵生产及现状谷氨酸是第一个成功用于发酵生产的氨基酸。
氨基酸的制取始于1820年，而直到1866年德国化学家里豪森才从小麦面筋里水解物里提取到一种碱性氨基酸-谷氨酸。
1957年，日本率先用微生物发酵法生产谷氨酸，从而结束了由水解或化学合成法而制取谷氨酸的时代[1]。
利用发酵法生产，有原料成本低，反应条件温和，可大规模生产等优点，是目前氨基酸生产的主要方法。
我国虽然发酵法生产谷氨酸稍晚，但现已成为世界产量和消费最大的国家。
以味精生产为例，其主要生产流程如下：目前，我国的味精相关产品发展迅速，产量高居世界首位。
据调查，2000-2006年味精行业平均每年增长17%。
我国味精年需求量为119万t，味精年人均占有量为769g，而台湾和港澳地区人均占有量为2500g，两者相差甚远。
农村味精市场发展较快，各类小食品、食品加工业冷藏盐渍食品和方便食品等不断增加，味精出口逐年扩大，销路日旺。
据调查预测，未来10年，中国味精相关产品产量将达到160万t。
味精市场空间较大，很有发展前景。
2 谷氨酸生产菌发酵机理2.1 谷氨酸生物合成途径谷氨酸代谢途径包括糖酵解途径(EMP)、磷酸己糖途径(HMP)、三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应(CO2固定反应)等。
谷氨酸发酵1）生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.（3）添加表面活性剂添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.谷氨酸发酵强制控制工艺为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。
谷氨酸发酵1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃3.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃.4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程（1）是代谢控制发酵的典型代表（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的……整个过程可简单的分为2 个阶段:第1阶段是菌体生长阶段;第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。
21卷2期2005年3月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.21 N o.2March 2005Received :August 11,2004;Accepted :October 27,2004.3C orresponding author.T el :86251025874341;E 2mail :jianzhuge @谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与谷氨酸合成G lyoxylate Cycle is R equired for the Overproduction ofG lutamate but is not Essential for Corynebacterium glutamicum G row th on G lucose余秉琦,沈 微,王正祥,诸葛健3Y U Bing 2Qi ,SHE N Wei ,W ANG Zheng 2X iang and ZH UGE Jian 3江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214036K ey Laboratory o f Industrial Biotechnology o f Ministry o f Education ,Southern Yangtze Univer sity ,Wuxi 214036,China摘 要 为阐明谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系,以谷氨酸棒杆菌基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum AT CC 13032为出发菌株,构建了乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacterium glutamicum WT ΔA 。
该菌株没有异柠檬酸裂解酶活性,不能在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长。
与出发菌株AT CC 13032相比,WTΔA 在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时不受影响,说明谷氨酸棒杆菌并不需要乙醛酸循环途径提供菌体生长所需的能量和生物合成反应所需的中间产物。
但是,与出发菌株AT CC 13032相比,WT ΔA 的谷氨酸合成能力大幅下降。
关键词 谷氨酸棒杆菌,乙醛酸循环,异柠檬酸裂解酶,谷氨酸中图分类号 Q591 文献标识码 A 文章编号100023061(2005)022*******Abstract The gly oxylate cycle was hypothesed to be indispensable for glutamate overproduction in coryneform bacteria ,for it was thought to fulfill anaplerotic functions and to supply energy during the grow th phase.During glutamate overproduction phase ,however ,it has been noted that the high level of the cycle is detrimental to the glutamate production.In order to clarify the rela 2tionship between the glutamate production and the gly oxylate cycle ,a chrom osomal aceA 2disrupted mutant of w ild 2type C .glu 2tamicum ATCC 13032was constructed.The isocitrate lyase (IC L )activity of the parental strain was 01011u Πmg of protein andreached 11980u Πmg of protein after acetate induction ;the mutant strain WT ΔA ,however ,had no detectable IC L activity and wasno longer able to grow on m inimal medium w ith acetate as the sole carbon source.C om pared w ith the w ild 2type C .glutamicumWT ,the mutant strain WT ΔA ,exhibited the same grow th rate w ith glucose as the sole carbon source ,indicating gly oxylate cycle is not required for its grow th on glucose.On the contrary ,the glutamate production in WT ΔA was severely im paired and m ore re 2sidual glucose was found in the fermentation broth at the end of fermentation w ith the mutant strain than w ith the w ild 2type strain.Further investigations into the relationship between the glutamate production and the gly oxylate cycle are under the way ,which may help to elucidate the mechanism of glutamate overproduction.K ey w ords Corynebacterium glutamicum ,gly oxylate cycle ,isocitrate lyase ,glutamate 谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum 是40多年来世界氨基酸生产的主要菌株。
最近Coryne 2bacterium glutamicum AT CC 13032的基因组测序工作已经完成[1]。
该项工作的完成促进和方便了国内外研究人员采用分子生物学的方法对棒杆菌做更深入的研究。
按照以往总结出的有关谷氨酸生产菌株的特点,乙醛酸循环为必需的代谢途径,这是因为以糖质原料发酵生产谷氨酸时,在谷氨酸发酵的菌体生长期,菌体需要它来提供部分能量和生物合成反应所需的中间产物,但同时指出,在菌体生长期后的谷氨酸合成期,为了大量生成和积累谷氨酸,最好封闭乙醛酸循环途径。
这是因为如果三羧酸循环中的四碳二羧酸100%地由C O2固定反应供给,则糖酸转化率为8711%;如果四碳二羧酸100%地由乙醛酸循环供给,则糖酸转化率只有5414%[2-3]。
此外,另有报道称用同位素标记的方法进行的代谢流分析表明当谷氨酸棒杆菌在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上生长时乙醛酸循环途径没有活性[4]。
为阐明乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系,我们以基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum AT CC13032为出发菌株,采用基因敲除的方法获得乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株,然后通过比较突变株与出发菌株在生长和谷氨酸合成方面的异同,对乙醛酸循环与谷氨酸合成之间的关系做一个初步研究。
1 材料与方法111 材料11111 菌株和质粒:所用菌株和质粒见表1。
表1 菌株和质粒T able1 B acterial strains and plasmidsS trains or plasm ids Relevant characteristics S ource or reference S trains E.coli JM109rec A1endA1gyr A96thi hsdR17supE44relA1Δ(lac2pro AB)ΠF’(traD36pro AB+lacI q lacZΔM15)Our lab JM110dam dcm thi hsdR17supE44leu rpsL1lacY galK galT ara tonA thr tsxΔ(lac2pro AB)ΠF’(traD36pro AB+lacI q lacZΔM15)Our lab C.glutamicum ATCC13032WT T ype strain CICC ATCC13032WTΔAΔace A∷Ωkm This w ork Plasm ids pUC18Ap r,ori of C olE1Our lab pSK symΩK m Ap r,K m r,ori of C olE1Our lab pA1pUC18carrying ATCC13032Δace A This w ork pAK pUC18carrying ATCC13032Δace A∷Ωkm This w ork 11112 培养基:LB培养基用于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的培养,LB固体培养基添加2%琼脂,需要的时候,抗菌素按以下浓度添加:氨苄青霉素100μgΠm L,卡那霉素50μgΠm L。
用于谷氨酸棒杆菌生长曲线绘制的基本培养基:1210gΠL K2HPO4,012gΠL MgS O4・7H2O,110gΠL(NH4)2S O4,根据需要添加的碳源为115%葡萄糖,115%乙酸。
谷氨酸发酵种子培养基:215%工业葡萄糖,0125%尿素,215%玉米浆, 011%K H2PO4,0104%Mg S O4・7H2O,发酵培养基: 5%工业葡萄糖,2%(NH4)2S O4,011%K H2PO4, 0104%MgS O4・7H2O,2mgΠL MnS O4・4H2O,013%玉米浆,5%CaC O3。
11113 酶与试剂:限制酶、T4DNA ligase、低熔点琼脂糖购于T aK aRa公司。
PCR所用试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
引物合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。
其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
112 方法11211 乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacterium glutamicum WTΔA的构建:质粒和染色体DNA提取、酶切反应、DNA片段回收、连接反应、大肠杆菌的转化等常规技术的操作参照文献[5]进行。
谷氨酸棒杆菌的电转化方法参照文献[6]进行。
