第二章 透射电子显微镜试样的制备方法

透射电子显微镜的样品制备方法透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）作为一种高分辨率的显微镜，被广泛应用于材料科学、生物医学等领域的研究中。

然而，为了进行TEM观察，样品制备过程是至关重要的。

本文将介绍几种常见的透射电子显微镜样品制备方法。

首先，最常见的样品制备方法之一是薄片法。

这种方法适用于研究固体材料，如金属、陶瓷和聚合物等，甚至是生物样品。

制备薄片的关键是薄化和抛光样品。

首先，将样品制备成小块或片状。

然后，使用切割机、研磨机或离心切片机将样品切割成适当大小的厚度。

接下来，使用细砂纸或悬浮液对样品进行抛光，直到获得适当的薄度和平滑度。

最后，使用溶剂将样品转移到TEM网状铜网上，以进行电子显微镜观察。

其次，还有一种常见的样品制备方法是焦散法。

与薄片法不同，焦散法主要用于观察液态材料。

例如，溶液中的纳米颗粒和生物分子等。

使用焦散法时，首先将样品放置在一块透明的碳膜上。

然后，用纯水或其他适当的溶液将样品冲洗干净。

在样品干燥之前，使用过滤纸或吸水纸轻轻吸取多余的溶剂。

一旦样品干燥，就可以将其放置在TEM中进行观察。

除了以上两种常见的样品制备方法外，还有一种称为离子切割法的技术。

这种方法主要适用于固体样品，特别是那些被称为厚度大于100nm的样品。

离子切割法的关键是使用离子束切割出更薄的样品层。

首先，将样品与一层保护层（常用的是金属膜）叠加在一起，以增强样品的结构稳定性。

然后，使用离子切割机将保护层以下的样品层剥离下来。

通过不断剥离，获得更薄的样品层。

最后，将样品放在TEM网状铜网上，准备进行电子显微镜观察。

需要注意的是，以上提到的样品制备方法仅代表了常见的几种，针对不同的研究目的和样品性质，还有许多其他的制备方法和技术。

对于研究者来说，选择适合自己研究的样品制备方法至关重要。

综上所述，透射电子显微镜的样品制备方法多种多样，如薄片法、焦散法和离子切割法等。

透射电子显微镜样品制备技术样品制备旳措施随生物材料旳类型以及研究目旳而各有不一样。

对生物组织和细胞等，一般多用超薄切片技术，将大尺寸材料制成合适大小旳超薄切片，并且运用电子染色、细胞化学、免疫标识及放射自显影等措施显示多种超微构造、多种化学物质旳部位及其变化。

对生物大分子（蛋白质、核酸）、细菌、病毒和分离旳细胞器等颗粒材料,常用投影、负染色等技术以提高反差,显示颗粒旳形态和微细构造。

此外尚有以冷冻固定为基础旳冷冻断裂──冰冻蚀刻、冷冻置换、冷冻干燥等技术。

超薄切片术将小块生物材料，用液态树脂单体浸透和包埋，并固化成塑料块，后用超薄切片机切成厚度为500埃左右,甚至只有50埃旳超薄切片。

超薄切片旳制备程序与光学显微镜旳切片程序类似，但各环节旳规定以及所使用旳试剂和操作措施有很大差异。

固定选用合适旳物理或化学旳措施迅速杀死组织和细胞,力争保持组织和细胞旳正常构造,并使其中多种物质旳变化尽量减小。

固定能提高细胞承受包埋、切片、染色以及电子束轰击旳能力。

重要固定措施有：①迅速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他措施使生物材料急剧冷冻，使组织和细胞中旳水只能冻结成体积极小旳冰晶甚至无定形旳冰──玻璃态。

这样，细胞构造不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保留其生物活性，可溶性化学成分（如小分子有机物和无机离子）也不致流失或移位。

用冷冻旳组织块，可进行切片、冷冻断裂、冷冻干燥和冷冻置换等处理。

用此法固定旳样品既可提供组织、细胞构造旳形态学信息，又可提供有关旳细胞化学信息。

②化学固定，固定剂有凝聚型和非凝聚型两种，前者如光学显微术中常用旳乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体,构造发生重大变化,常导致细胞旳细微构造出现畸变。

非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛类固定剂和四氧化锇，四氧化钼等，合用于电子显微。

它们对蛋白质有较强旳交联作用,可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚,防止了过度旳构造畸变。

如何制备透射、扫描电子显微镜样品[仪器使用说明] 如何制备透射、扫描电子显微镜样品？透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜(scanning electron microscope)的区别是：前者总放大倍数可在1000-1000000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20-300000倍之间变化。

它们的制备过程如下：器材1.菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。

2.溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷钨酸钠（pH6.5-8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素c，醋酸铵，质粒pBR322。

3.仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。

三、操作步骤（一）透射电镜的样品制备及观察1.金属网的处理光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。

而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃，只能采用网状材料作为载物，通常称为载网。

载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是200-400目（孔数）的铜网。

网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。

本实验选用的是400目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。

如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸1~2分钟，或在1% NaOH 溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。

2.支持膜的制备在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜。

支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20nm；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右。

第二节透射电镜样品的制备一、表面复型和萃取复型技术（一）复型样品成像原理复型样品是一种间接试样，是用中间媒介物（碳、塑料薄膜）把样品表面浮雕复制下来，通过对浮雕的观察间接地得到样品表面组织形貌。

一定能量的入射电子照射到样品上要受到样品内原子核与核外电子的作用，产生弹性散射与非弹性散射。

非晶体复型样品成像主要取决于入射电子与试样中原子相互作用所产生的电子散射。

电子束穿过样品时在样品厚的区域或原子序数大的区域受散射程度大，反之则小。

这就是所谓的质厚衬度效应。

如果在样品下方加一光阑，那么散射角大于光阑孔径角的电子被光阑挡住或吸收，而不能穿过光阑孔参与成像。

散射角小于或等于光阑孔径角的电子就能穿过光阑孔参与成像，因此在荧光屏上就形成了明暗不同的衬度，产生了样品的图像。

图5—10为复型样品成像示意图。

（二）复型样品制备技术1．对金相试样的要求电镜的高分辨本领使它能够显示出金属组织的微细特征。

为使组织微细特征不在制备试样时失真，对图5—10 复型样品成像示意图金相试样的制备要求严格。

否则会造成假像影响对观察结果的分析。

试样要细心磨制，仔细抛光，力求避免产生微小的磨痕及变形层。

浸蚀剂与做金相试样时所用的浸蚀剂相同，浸蚀应浅些，这样可保留组织细节。

如果浸蚀过重就可能引起相界、晶界的过浸蚀，导致失真、脱落，甚至会出现腐蚀坑等假象。

2．AC纸的制作AC纸就是醋酸纤维素薄膜，是用6%醋酸纤维素丙酮溶液制作的塑料薄膜。

为了使AC 纸质地柔软、渗透性强并具有蓝色，在所配制的溶液中再加入2%磷酸三苯脂和几粒甲基酯。

待醋酸纤维素在丙酮中溶解后将其倒在干净、平滑的玻璃板上，倾斜转动玻璃板，使溶液均匀展开。

然后用玻璃钟罩扣上，让钟罩下边与下板间留有一定间隙以便于丙酮挥发。

大约经过24小时后AC纸干透，用小刀片轻划AC纸边缘，小心揭下即可。

3．塑料—碳二级复型塑料—碳二级复型由于其制备过程不损坏金相试样表面，重复性好，供观察的第二级复型—碳膜导电、导热性好，在电子束照射下较为稳定，因而得到广泛的应用。

透射电子显微镜晶体样品制备技术一、透射电子显微镜（TEM）简介透射电子显微镜是一种利用电子束作为照明源的高分辨率显微镜，它能够提供原子级别的图像分辨率。

TEM在材料科学、纳米技术、生物学和医学等领域有着广泛的应用。

通过TEM，研究人员可以观察到材料的微观结构、晶体缺陷、纳米颗粒的形状和尺寸等。

1.1 透射电子显微镜的工作原理TEM的工作原理基于电子束通过样品后，与样品中的原子相互作用，产生散射和吸收，从而形成图像。

电子束由电子枪产生，经过加速和聚焦后，穿过极薄的样品，然后由探测器接收并转换成图像。

1.2 透射电子显微镜的组成TEM主要由以下几部分组成：- 电子枪：产生电子束的装置。

- 聚光镜：用于聚焦电子束。

- 样品室：放置样品的位置。

- 物镜：进一步放大样品的图像。

- 中间镜和投影镜：用于进一步放大和投影图像到荧光屏或相机。

1.3 透射电子显微镜的优势- 高分辨率：能够达到原子级别的分辨率。

- 多种成像模式：包括明场成像、暗场成像和高角环形暗场成像等。

- 元素分析能力：通过能量色散X射线光谱（EDS）和电子能量损失谱（EELS）进行元素分析。

二、晶体样品的制备技术为了在TEM中获得高质量的图像，样品必须非常薄且均匀，通常厚度在几十到几百纳米之间。

晶体样品的制备技术对于TEM成像至关重要。

2.1 样品制备的基本要求- 极薄：样品厚度需小于电子束的穿透深度。

- 均匀：样品厚度应均匀一致。

- 无污染：样品表面应清洁，避免污染。

- 无损伤：制备过程中应避免对样品造成损伤。

2.2 晶体样品的制备方法- 机械减薄：通过机械研磨和抛光减小样品厚度。

- 化学减薄：利用化学腐蚀方法减少样品厚度。

- 离子减薄：使用离子束对样品进行刻蚀，以减小厚度。

- 聚焦离子束（FIB）：一种高精度的减薄技术，可以在特定区域进行减薄。

2.3 样品支撑膜的选择- 网格材料：通常使用铜网、镍网或钼网等作为支撑膜。

- 网格孔径：孔径大小影响样品的支撑和电子束的穿透。

第二章 电子显微分析第三节 透射电子显微分析1．试述透射电镜的结构。

通常透射电子显微镜主要由光学成像系统、真空系统和电气控制系统三部分组成。

（1）光学成像系统：1 照明部分：电子枪、聚光镜。

2成像放大系统：物镜、中间镜、投影镜。

3图像观察记录部分。

4样品台。

（2）真空系统；（3）电气系统：灯丝电源和高压电源、磁透镜稳压稳流电源、电气控制电路。

2．透射电镜中粉末样品和薄膜样品的制备方法及要求？答：（1）粉末样品：用超声波分散器将需要的粉末在溶液（不与粉末发生作用的）中分散呈悬浮液。

用滴管滴几滴在覆盖有碳加强火棉胶支持膜的电镜铜网上。

待其干燥（或用滤纸吸干）后，在蒸上一层碳膜，即成为电镜观察用的分散情况，可用光学显微镜进行观察。

也可把载有粉末的铜网再作一次投影操作，以增加图像的立体感，并可根据投影“影子”的特征来分析粉末颗粒的立体形状。

（2）薄膜样品：块状材料是通过减薄的方法（需要先进行机械或化学方法的预减薄）制备成对电子束透明的薄膜样品。

减薄的方法有超薄切片、电解抛光、化学抛光和离子轰击等。

超薄切片方法适用于生物试样。

电解抛光减薄方法适用于金属材料。

化学抛光减薄方法适用于在化学试剂中能均匀减薄的材料，如半导体、单晶体、氧化物等。

无机非金属材料大多数为多相、多组分的的非导电材料，上述方法均木适用。

直至60年代初产生了离子轰击减薄装置后，才使无机非金属材料的薄膜制备成为可能。

3. 试述离子轰击制备薄膜样品的过程原理？答：（1）过程：离子轰击减薄是将待观察的试样按预定取向切割成薄片，再经机械减薄抛光等过程预减薄至30～40 m的薄膜。

把薄膜钻取或切取成尺寸为2.5～3mm的小片，装入离子轰击减薄装置进行离子轰击减薄和离子抛光。

（2）减薄原理：在高真空中，两个相对的冷阴极离子枪，提供高能量的氩子流，以一定角度对旋转的样品的两面进行轰击。

当轰击能量大于样品材料表层原子的结合能时，样品表层原子受到氩离子击发而溅射，经较长时间的连续轰击、溅射最终样品中心部分穿孔。