透射电子显微镜Ⅰ. 实验目的（1）掌握透射电镜的基本构成（2）掌握透射电镜的成像原理（3）了解透射电镜的操作过程（4）了解生物样品的制备过程（5）利用透射电镜观察纳米材料和生物样品Ⅱ. 仪器及技术指标（1）型号：Hitachi（日立）-7650型透射电镜（2）加速电压：40kV ~ 120kV（3）放大倍数：200 ~ 60万倍图1Hitachi-7650型透射电镜Ⅲ. 透射电镜的基本构成透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM），简称透射电镜，是以波长很短的电子束做照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种具有高分辨本领、高放大倍数的电子光学仪器。
图2透射电镜剖面结构示意图1. 电子光学系统：又称镜筒，是TEM的核心。
发射并使电子加速的电子枪（1）照明部分：会聚电子束的聚光镜电子束平移、倾斜调节装置作用：提供亮度好、相干性好、束流稳定的照明电子束。
物镜中间镜（2）成像部分：投影镜物镜光阑选区光阑穿过试样的透射电子束在物镜后焦面上成衍射花样，在物镜像平面上成放大的组织像，并经过中间镜、投影镜的接力放大，获得最终的图像。
荧光屏（3）观察记录部分照相机试样图像经过透镜多次放大后，在荧光屏上显示出高倍放大的像。
2. 真空系统：电子光学系统的工作过程要求在真空条件下进行，这是因为在充气的条件下会发生以下情况：栅极与阳极间的空气分子电离，导致高电位差的两极之间放电炽热灯丝迅速氧化，无法正常工作电子与空气分子碰撞，影响成像质量试样易于氧化，产生失真目前，一般TEM的真空度为10-5 Torr（1Torr＝133.32Pa）左右。
真空泵组经常由机械泵和扩散泵两级串联成。
为了进一步提高真空度，可采用分子泵、离子泵，真空度可达10-8 Torr或更高。
3. 电源与控制系统：电子枪加速电子用的小电流高压电源用于提供两部分电源透射激磁用的大电流低压电源Ⅳ. 透射电镜的成像原理：1. TEM是依照阿贝成像原理工作的平行入射波受到有周期性特征物体的散射作用在物镜的后焦面上形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。
2. 具体过程：电子枪产生的电子束经1～2级聚光镜后均匀照射到试样上的某一待观察微小区域上，入射电子与试样物质相互作用，由于试样很薄，绝大部分电子穿透试图3阿贝成像原理图样，其强度分布与所观察试样区的形貌、组织、结构一一对应。
透射出试样的电子经过物镜、中间镜、投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图形的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转变为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显示与试样形貌、组织、结构相对应的图像。
根据阿贝成像原理，穿过试样的透射电子束：在物镜像平面成放大的组织像，故TEM可做形貌分析在物镜后焦面成衍射花样，故TEM可做物相分析并经过中间镜、投影镜的接力放大，获得最终的图像。
Ⅴ. 透射电镜的操作过程1. 开机（1）打开循环水装置开关至“ON”。
（2）主机启动：顺时针旋转主机开关钥匙至“EVAC ON”，待机械泵启动后，再将钥匙顺时针转至“COL ON”启动计算机。
（3）等主机启动后约30分钟，“EVAC”指示灯由闪烁变绿后（说明真空已抽好），开始进行电镜观察。
2. 电镜观察（1）装样品：①将样品杆水平向外拉出，碰到第一次阻止时稍向顺时针方向（15°）旋转，碰到第二次阻止，接着水平向外拉，直到碰到第三次阻止，再逆时针（45°）旋转，碰到第四次阻止时，样品外室控制开关指示灯亮，变红色，按下开关至“OFF”，待指示灯灭后，水平拔出样品杆。
②将样品杆头部样品安装槽上的垫片取下，用尖头镊子夹取一个装有切片的铜网放入安装槽内，装上垫片，固定好，仔细检查有无松动现象。
③将样品杆水平插入样品室，待样品外室控制开关指示灯亮时，将开关转向“ON”的位置，待指示灯变绿色时，将样品杆沿着上述反方向送入样品室。
（2）加高压：点击电脑屏幕对话框中“HV ON”按钮，加高压至80 kV。
待高压稳定后，打开灯丝运行对话框，按“ON”加灯丝电压，接通灯丝电流。
（3）调光：荧光屏出现亮斑后进行电子束对中调整，并使亮斑均匀发散为止。
①按下“LENS”键，将光路恢复到初始状态。
②转动“BRIGHT”旋钮，将亮斑调小。
按下“BH”键，同时配合使用左右两边的万能调节旋钮，将亮斑调至荧光屏中央（使亮斑以荧光屏中央的十字叉“+”为圆心）。
按下“CS”键，同时配合使用左右两边的万能调节旋钮，将亮斑调成圆形。
（上述过程中，“BH”键和“CS”键可反复交替使用，直至将亮斑调至荧光屏中央，并成圆形）③转动“BRIGHT”旋钮，使亮斑均匀散开。
再通过调节聚光镜光阑旁边的两个小旋钮，使得到的亮圆与荧光屏形成同心圆。
（4）调样品：将样品杆完全推入样品室，此时在荧光屏上看到铜网的像。
找到铜网支持膜上有样品的位置，转动“MAG”旋钮，将放大倍数调至20 K倍（即2万倍）。
①按下“WOB”键，样品开始振动（样品高度引起）。
按下“SPOT”键，1个小的放大镜出现在荧光屏的中央（用于观察样品振动细节）。
此时借助放大镜，调节样品高度，直到样品不发生振动为止。
②按下“MODU”键，样品又开始振动（光引起）。
此时仍借助放大镜，并使用左右两边的万能调节旋钮，将样品调至不发生振动。
最后，按下“SPOT”键，将放大镜退出。
（5）增加样品反差：①找到铜网支持膜上有样品的位置，按下“DIFF”键（此时由图像模式变换至衍射模式），旋转物镜光阑旋钮，选择合适的物镜光阑孔，同时调节物镜光阑旁边的两个小旋钮，用物镜光阑孔将中心最亮的衍射斑点套住（使最亮衍射斑点成为物镜光阑孔的圆心）。
②按下“ZOOM1”键，此时又由衍射模式变换到图像模式。
（6）拍照：★①选定所要拍照的区域，转动“BRIGHT”旋钮，将光调暗。
用盖子盖上观察室，在电脑屏幕上进行操作，用CCD相机进行观察。
②在电脑屏幕上观察样品的形貌，通过转动“FOCUS”旋钮，观察样品在正焦、过焦和欠焦时所得图像的清晰度情况。
③经过精确调焦后（在稍欠焦的状态下拍得的图像最好），拍照并保存记录。
在拍照过程中要注意左右手的配合，同时将放大倍数、亮度、样品台移动、调焦等一系列动作密切协调，以达到最佳的观察效果。
（7）关机：①将灯丝电流关闭，再将高压关闭，放大倍数复位（3K倍左右），然后退出物镜光阑，将样品从样品杆中取出。
②将主机电源钥匙向逆时针转一格，先关闭计算机。
等计算机关闭后，继续逆时针转一格，关闭主机电源。
③约等30分钟后，机械泵完全停止工作（“EVAC”和“AIR”指示灯都熄灭），此时关闭循环水装置，切断总电源。
3. 紧急处理：（1）在观察过程中遇到意外情况时，必须停止操作，并通知电镜室负责人，待意外情况排除后，得到电镜室负责人同意方能继续观察。
（2）遇到突然停电，首先将主机电源开关关闭，约等30分钟后关闭循环水。
Ⅵ. 透射电镜的应用1. 利用透射电镜观察纳米材料图4纳米Au棒（左）和纳米三角Ag颗粒（右）的TEM照片2 利用透射电镜观察生物样品生物样品的制备过程：图5生物样品的制备过程（1）取材：﹤1 mm3将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。
此过程中要做到“快、小、准、冷”（2）固定：目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。
物理化学：化学试剂四氧化锇戊二醛（3）脱水：保证包埋介质完全渗入组织内部。
脱水剂乙醇丙酮为了避免急骤脱水引起细胞的收缩，脱水应梯度进行。
如：70％丙酮15分钟，80％丙酮15分钟，90％丙酮15分钟，100％丙酮10分钟（二次）。
（4）包埋：常用的包埋剂：环氧树脂利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在聚合前为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。
常规方法是将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后置烘箱烘干，在45℃（12小时）、60℃（36小时）烘箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。
图6包埋模版（5）超薄切片：采用超薄切片机将包埋块进行切片，得到50～70nm的超薄切片。
图7 Leica超薄切片机（6）染色：目的是为了增强样品的反差。
一般用重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附来达到染色的目的。
染色剂醋酸铀柠檬酸铅（7）电镜观察、拍片、记录等。
图8花粉细胞的TEM照片Ⅶ. 参考书目：（1）黄孝瑛《透射电子显微学》上海科学技术出版社，1987年（2）叶恒强、王元明《透射电子显微学进展》科学出版社，2003年（3）章晓中《电子显微分析》清华大学出版社，2006年（4）付洪兰《实用电子显微镜技术》高等教育出版社，2004年（5）凌诒萍《细胞超微结构与电镜技术》复旦大学出版社，2007年（6）徐柏森、杨静《实用电镜技术》东南大学出版社，2008年Ⅷ. 思考题:（1）简述TEM电子光学系统的组成及各部分的作用。
（2）TEM的成像原理是什么？具体的成像过程是什么？（3）简述TEM的操作过程。
（4）简述生物样品的制备过程。
