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实验四粗糙链孢霉顺序四分子分析一、目的1. 了解粗糙链孢霉的生活周期及特性。
2. 通过对粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，了解顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。
二、原理粗糙链孢霉（Neurospora crassa）属于真菌中的子囊菌纲。
它是进行顺序四分子分析的好材料。
粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
由菌丝顶端断裂形成分生孢子。
分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分子孢子中含有几个核。
分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这样形成粗糙链孢霉的无性生殖过程。
粗糙链孢霉除无性生殖过程外，也可以进行有性生殖。
粗糙链孢霉的菌株具有两种不同的接合型（mating type），用A, a或mt+, mt-表示。
接合型是由一对等位基因控制的，并符合孟德尔分离定律。
没接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，有性孢子可很快进入减数分裂。
有性生殖过程有两种方式：1. 当菌丝在有性生殖的杂交培养基上增殖时，就会产生原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。
进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。
钩状细胞顶端细胞的两核形态合子，合子核再进行减数分裂，分为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成8个核，顺序地排列在一个子囊中。
原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子中果。
一个子囊果中有30～40个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30～40μm，比3～5μm的分生孢子要大得多。
子囊孢子如经60℃处理30～60分钟，便会发芽，长出菌丝，进入无性繁殖。
2. 不同接合型的菌丝相接触，两核配对，但不融合，形成形成双核体，随着双核体菌丝的发育，子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊，即子囊进行发育。
粗糙链孢霉的四分子分析粗糙链孢霉（Fusarium spp.）是一类重要的真菌属，存在于土壤、植物、食物和环境中。
它们是常见的植物病原菌，同时也是人和动物的致病菌。
粗糙链孢霉具有广泛的遗传多样性，因此其分子分析成为研究者们研究该菌属的重要手段之一四分子分析是一种基于利用四个核糖体RNA基因（18SrDNA，ITS，28SrDNA和5.8SrDNA）来研究粗糙链孢霉的分子方法。
这四个基因都具有高度保守性和可变性序列，既可以用于确定种属和亚种，也可以用于比较不同菌株之间的遗传关系和进化关系。
下面将详细介绍四分子分析在粗糙链孢霉研究中的应用。
首先，18SrDNA是真菌核糖体RNA基因的一部分。
通过对不同粗糙链孢霉菌株的18SrDNA序列进行比对和分析，可以建立菌株之间的系统发育树，确定它们的亲缘关系。
例如，研究者们通过比较不同菌株的18SrDNA 序列，发现不同的粗糙链孢霉菌株可以分为几个主要的物种群，这有助于更好地理解该菌属的遗传多样性和分类学。
此外，18SrDNA序列的变异还可以用于区分不同的亚种或菌株的变异程度。
其次，ITS（Internal Transcribed Spacer）是连接18S rDNA和28S rDNA的一个高变性序列区域。
ITS序列在粗糙链孢霉研究中被广泛应用于种属鉴定和系统发育分析。
通过测定不同菌株的ITS序列，研究者们可以确定它们属于哪个物种，以及它们之间的亲缘关系。
例如，通过对不同菌株的ITS序列进行比较，研究者们发现了一些新物种和新亚种，并修正了传统分类学中存在的一些问题。
此外，ITS序列的变异还可以用于研究菌株之间的遗传进化关系和地理分布。
再次，28SrDNA是真菌核糖体RNA基因的另一个重要组成部分。
通过分析不同菌株的28SrDNA序列，研究者们可以进一步确认它们的种属和亚种，以及它们的系统发育关系。
此外，28SrDNA序列的变异还可以用于研究菌株之间的多样性和表型变异。
真菌类的遗传分析————四分子分析与作图一粗糙脉孢霉的性质与生活史（一）粗糙脉孢霉的性质粗糙脉孢霉( Neurosporocrassa ) 属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。
每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
是遗传分析好材料:1子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。
2 一次只分析一个减数分裂的产物。
3体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。
4能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。
5 更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。
（二）粗糙链孢霉的生活史粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。
二 顺序四分子与遗传分析 （一）顺序四分子 (ordedtetrad)粗糙脉霉菌减数分裂的四个产物保留在一起，称为四分子。
但是，在分裂的过程中子囊的外形比较狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴中，这样所有分裂后的核――８个子囊孢子都是从上到下排列成行，所以，脉孢菌减数 分裂所产生的四分子是属于顺序四分子(ordedtetrad)。
可推知：第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体; 第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体同源染色体的姊妹染色单体。
无性世代（单倍体世代）：菌丝体 →分生孢子→ 菌丝体。
粗糙脉孢菌（ NeurosporaCra ssa ）的生殖方式有性世代（双倍体世代）：一个交配型的分生孢子落在另一交配型原子囊壳受精丝上，从而进入原子囊（子实体），进行多次有丝分裂，形成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂，每个二倍体核形成4个单倍体核，再进行一次有丝分裂，形成8个核，最后形成为一个子囊中的8个子囊孢子。
无性孢子——分生孢子 有性孢子——子囊孢子这种顺序四分子在遗传分析上有很多优越性:(1). 可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。
脉孢菌的遗传学分析——粗糙脉孢菌的两性无核子囊孢子在这次以及以往对于脉孢菌遗传机理的研究中，研究人员切割分析了成百上千的粗糙脉孢菌，一个特定子囊中的八个子囊孢子分别发育成为菌丝体，而后分别给这些菌丝体做性别鉴定，结果发现，这些子囊中只有一个包含了双性孢子。
在这一案例中，当把来自于同一子囊的八个孢子分离后置于人工培养基上培养时，只有由孢子1、2、5、6发育成的菌丝体产生了子囊壳或有性后代，而由孢子3、4、7、8发育得到的菌丝体具有很小的透明结构，而且不能够进行出芽生殖。
一般粗糙脉孢菌的子囊包含了八个成熟的子囊孢子，在性别反应中，其中的四个为完全的（+），其余的四个为完全的（—）。
通过对杂交过程中产生的其他的异常子囊进行分析，但是发现全部都是标准形式。
在粗糙脉孢菌的四分子中四个双性分子有规律的产生于每个子囊之中。
但是这些子囊中不成熟、“发育不全”的孢子从未发现过。
DODGE（1927）已经发现这些粗糙脉孢菌四分子的双性分子是在孢子切出之前通过接近相反性别的两个极点而形成的，而这两个被接近的极点的内含物存在于一个单一的孢子壁之中。
通过对粗糙脉孢菌和N.sitophila的研究，他在其他的子囊中发现有些单独的子囊中包含有两个或两个以上（有时是八个）极点。
MOREAU和MORUZI也报道了相似的案例，但是所有那些子囊与在这里报道的都不相同。
在手头上这个案例中，出四个双性孢子之外还发现了四个无核孢子。
有这四个双性孢子分别发育而来的菌丝体产生了无性分生孢子（还有有性的子囊壳）。
细菌培养是从四条线路的每一条所产生的单独的分生孢子开始的由于分生孢子一般是多喝的，研究人员预期大多数的有这四条线路分别产生的菌丝体应该是双核的。
而事实也正是如此。
研究人员从孢子一线路中得到了24个双性分生孢子，从孢子二线路中得到了12个双性分生孢子，从孢子五线路中得到了23个双性分生孢子，从孢子六线路中得到了18个双性分生孢子。
然而，在每个孢子的后代中也发现了单性的分生孢子，如下图所示：孢子一线路1个正常的（+）分生孢子孢子二线路5个正常的（—）分生孢子和7个棕褐色的（+）分生孢子孢子五线路2个正常的（+）分生孢子和1个棕褐色的（—）分生孢子孢子六线路1个正常的（—）分生孢子和4个棕褐色的（+）分生孢子异核体结构的对称性表明了孢子一线路中（—）成分的缺失可能是棕褐色（—）分生孢子。
真菌类的遗传分析
————四分子分析与作图一粗糙脉孢霉的性质与生活史
（一）粗糙脉孢霉的性质
粗糙脉孢霉( Neurosporocrassa ) 属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。
每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
是遗传分析好材料:
1子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。
2 一次只分析一个减数分裂的产物。
3体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。
4能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。
5 更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。
（二）粗糙链孢霉的生活史
粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。
二 顺序四分子与遗传分析 （一）顺序四分子 (ordedtetrad)
粗糙脉霉菌减数分裂的四个产物保留在一起，称为四分子。
但是，在分裂的过程中子囊的外形比较狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴中，这样所有分裂后的核――８个子囊孢子都是从上到下排列成行，所以，脉孢菌减数 分裂所产生的四分子是属于顺序四分子(ordedtetrad)。
可推知：第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体; 第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体同源染色体的姊妹染色单体。
无性世代（单倍体世代）：
菌丝体 →分生孢子→ 菌丝体。
粗糙脉孢菌
（ NeurosporaCra ssa ）的生殖方式
有性世代（双倍体世代）：
一个交配型的分生孢子落在另一交配型原子囊壳受精丝上，从而进入原子囊（子实体），进行多次有丝分裂，形成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂，每个二倍体核形成4个单倍体核，再进行一次有丝分裂，形成8个核，最后形成为一个子囊中的8个子囊孢子。
无性孢子——分生孢子 有性孢子——子囊孢子
８个子囊孢子都是
从上到下排列成行
这种顺序四分子在遗传分析上有很多优越性:
(1). 可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。
(2). 子囊中子囊孢子的对称性，证明减数分裂是一个交互过程，而非单向过程。
(3).可以检验染色单体的交换有否染色单体干涉现象，还可利用它来进行基因转变(gene conversion)的研究。
(4).证明双交换不仅可以包括4线中的两线, 而且可以包括3线或4线双交换。
（二）着丝粒作图与遗传分析
利用四分子分析法，测定基因与着粒间的距离称为着丝粒作图。
着丝粒作图是基于这样的事实：
减数分裂中在同源染色体的一对非姊妹染色单体的着丝粒和某杂合基因座间有没有发生交换，和其产物四分子中的等位基因在排列方式上是不同的。
可分为两种：
第一次分裂分离（图示一种可能）
第二次分裂分离（图示一种可能性）
利用四分子分析，测定基因与着丝粒间的距离，即根据子囊孢子基因型的排列顺序，计算基因与着丝粒的重组率，确定基因与着丝粒之间的距离和排列顺序。
一对基因的遗传分析
材料
有两种不同接合型的脉孢菌菌株：
•一种是能合成赖氨酸(lysine)的野生型菌株(记作lys+，或+)，该菌株成熟的子囊孢子呈黑色。
•另一种是赖氨酸缺陷型(记作lys —或—)，这种菌株的子囊孢子成熟较迟，呈灰色。
序号子囊类型子囊数分裂类型
将这两种菌株杂交
杂种子囊减数分裂的产物根据黑色孢子和灰色孢子的赖氨酸缺陷型(lys-) ×野生型(lys+)，排列次序可有6种子囊型，为方便起见只写出其4个孢子对( spore pairs)，其计数的结果：
序号子囊类型子囊数分裂类型
序号子囊类型子囊数分列类型
1 + + ——105 M1
非交换型
2 ——+ + 129
3 + —+ —9
4 —+ —+ 5
M2
交换型5 + ——+ 10
6 —+ —+ 16
将表3-7中所观察到的各类子囊数代入上式可得：
lys+基因与着丝粒间的图距是7.3cM
两个基因的连锁图形
利用顺序四分子分析，同样可以进行两个基因的连锁作图
nic（nicotinic acid）为烟酸依赖型n
ade（adenine）为腺嘌呤依赖型a
对子囊进行分类统计，不考虑孢子排列顺序，根据性状组合将四分子分为三种类型PD: 亲二型（parental ditype)：孢子有2种基因型，且与亲代相同. NPD: 非亲二型（non-parental ditype)：孢子有2种基因型，且与亲代不同. 如果PD:NPD=1:1，则两个基因自由组合，否则连锁。
T: 四型（tetratype):孢子有4种基因型，2种与亲代相同, 2种与亲代不同.
首先判断n、a基因是独立分配还是连锁。
根据上表中的数字，PD=808+90=898，NPD=1+1=2。
如果这两个基因是自由组合的话，可以预期PD∶NPD=1∶1，而实验结果PD>>NPD。
说明这两个基因不是自由组合，而是相互连锁的。
其次计算着丝粒(•)与基因(n)、(a)间的重组率(RF)及基因离着丝粒的距离
5.05＜9.5，所以n基因比a基因离着丝粒近
n、a在染色体上的排列可能有两种方式：在着丝粒的同侧或者是异侧。
1先判断基因的在同侧还是异侧
(1)如果n、a在异侧上，则PD与NPD都是由双交换形成，因而PD与NPD的频率相等。
但是，上表的实验数据显示，同处MⅡMⅡ的PD子囊数为90，同处MⅡMⅡ的NPD子囊数为1。
PD多于NPD
于是n、a在同侧。
(2)另一种方法是在n和a分别为MⅠ和MⅡ的情况下，对子囊数与RF(•—n)，RF(•—a)进行比较分析
已知RF(•—nic)=5.05％，RF(•—ade)=9.3％，两者相差不到一倍，若n和a各自独立地与着丝粒发生重组的话，则MⅡ的子囊数也应相差不到一倍。
但实际上，交换发生在着丝粒与a 间，n是MⅠ，a是MⅡ的子囊有90个；交换发生在着丝粒与n间时，n是MⅡ，a是MⅠ的子囊只有55个。
两者相差悬殊，与计算的重组值不相符合。
所以，这两个基因不可能独自与着丝粒发生交换。
另外，从上表可见，在n与着丝粒发生交换时，a基因也与着丝粒交换了，即n是MⅡ，a也是MⅡ共计96(=90＋1＋5)个子囊。
也就是说，同一交换使十/n出现MⅡ型分离，也使十／a出现MⅡ型分离，101次中有96
次，证明了n和a的连锁关系是同侧
n—a间的重组率可用公式：
5.05＋5.2=10.25>9.3
由果蝇的三点测交的遗传分析中可知，造成这一结果的根源是着丝粒—a基因间发生过双交换。
当我们回顾先前所述的计算过程时可以发现，在求RF(•—a)时，是把所有MⅡ的子囊相加除以2倍的总子囊数，这样把少量的在•—a间起过交换的子囊遗漏了。
例如子囊型4，对于十／a来讲，是属于MⅠ，但是我们决定了•—n—a顺序之后，得知这些子囊中发生了双交换，可是在计算•—a间的重组值时，却没有把这两次单交换计算在内，因而使•—a间的重组值的估计偏低。
因此，被低估的重组值是（202+208—372）/4000 *100%=0.95%
所以
5.05＋5.2=9.3+0.95=10.25
基因在染色体上的位置如图。
