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红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)是两种常见的检验手段，用于检测血液中是否存在抗体，从而诊断某些疾病或病原体感染。
红细胞凝集试验(HA)
红细胞凝集试验(HA)是一种检测抗体与抗原反应的常规方法。
在这个测试中，医生或实验室技术人员将被测血浆放入红细胞凝集剂中，然后与已知抗原混合，比如病毒、细菌或其他病原体。
如果血浆中含有与已知抗原相应的抗体，那么红细胞就会和抗原结合在一起形成凝集。
如果血浆中没有抗体，红细胞就会分散在凝集剂中。
HA 可以检测出许多病原体的抗体，包括流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和风疹病毒等。
红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集抑制试验(HI)也是一种检测抗体和抗原反应的常规方法。
在这个测试中，被测血液中的抗体与已知抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，在复合物中加入未和抗原混合的红细胞，如果血浆中含有抗体，它们会与复合物结合，使得红细胞不会凝集。
如果血液中没有相应的抗体，红细胞就会在复合物中凝集。
与HA相比，HI适用于检测一些病原体，比如肝炎病毒和流感病毒等，但不是所有病原体都适合使用HI进行检测。
红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）是检测抗体和抗原反应的两种常见方法。
这两种技术可用于诊断许多疾病和病原体感染，但需要在临床实验室或医疗机构进行，由专业人员执行。
尽管这些测试非常有用和重要，但仍需要与其他诊断工具和检查方法相结合，以确保诊断的准确性和病人的治疗。
![[最新]ha、hi试验方法](https://img.taocdn.com/s1/m/b24e2eb6b1717fd5360cba1aa8114431b90d8e99.png)
红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验1．红细胞凝集试验 采用50孔板或试管法按表1，若采用96孔微量板法按表2进行，用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。
将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。
表1 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 血凝素稀释倍数 10 20 40 80 160 320 640 1280…… 0.5生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5……} } } } } } } } 弃0.5待检抗原 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1%鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.5表2 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 待检抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液2525252525252525252．红细胞凝集抑制试验 2.1血凝素凝集价测定 50孔板或试管法按表3，若采用96孔微量板法按表4进行。
表3 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 234567 8……血凝素稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 640……0.25生理盐水0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25……}} } } } } } } 弃0.25血凝素 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.251%鸡红细胞悬液 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25 生理盐水0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25表4 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256……25生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25……血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 生理盐水252525252525 2525252.2.1 4单位抗原工作液配制 选用上述2.1项抗原进行。
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）河南省乘风动物保健技术研究所一、实验用设备：●1、离心机1台（3000转离心红细胞）2、冰箱1台（存放抗原）3、振荡器1台（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和移液器配套使用8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用●11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：●抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
●1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放入4℃冰箱中可保存2—3天。
使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
现用现配。
●抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
●被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。
●吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。
水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
红细胞凝集实验（HA）与红细胞凝集抑制实验（HI）一：实验设备及仪器1.离心机一台（30000转）2.冰箱一台（存放抗原）3.振荡器一台（震荡96孔V型板）4.抗原：禽流感（AI）抗原，从厂家购买5.多孔移液器即排枪一把（量程为5到50微升，做稀释血清用）6.一次性枪头（高压灭菌后使用）7.1%到0.5%体积的鸡红细胞悬液（健康成年鸡的红细胞，但须严格洗五次）8.柠檬酸三钠（配置3.8%抗凝剂使用，制作红细胞悬液采鸡血时加入血液，防止血液凝固）9.吸管一毫升跟十毫升量程10.吸耳球：跟吸管配套使用11.蒸馏水：即无菌双蒸水，清洗96孔V型板12.10毫升离心管，离心红细胞用13.生理盐水：做血清稀释液用，及配置4单位抗原二：实验前准备1.抗原：根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原2.抗凝剂的配制：用分析天平称取3.8克柠檬酸三钠，溶解于100毫升生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1%红细胞悬液制作：去菜市场找杀鸡的，去找他们用试管接新鲜鸡血，试管中提前加入抗凝剂，加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2，并迅速混匀，在离心机中以3000转离心五分钟，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，不要弄碎了红细胞，再在离心机中3000转离心五分钟，弃去上清，再加生理盐水混匀，如此往复四到五次。
最后一次离心后，去掉上清，管低即为红细胞泥，用吸管吸取0.1毫升红细胞泥，然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液，现用现配不要长时间存放。
4.被检血清：乡镇送来的血液，离心取上清即为被检验血清，注意做标记，一管一标记，别弄混了。
5.血清稀释液：为灭菌生理盐水，即高压过的生理盐水三：实验步骤第一步：血凝（HA）实验，目的是测定抗原效价，即为了制作后面的四单位抗原1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升2.用微量移液器吸取待测抗原（就是你买的抗原）的25微升于第一孔中并且挤压六次混合，后吸出25微升至第二孔，依次倍比稀释到第11孔，11孔中弃去25微升。
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）2007-12-07 11:42用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
用户名: 密码: 登录注册畜牧兽医知识的天堂主页博客相册|个人档案|好友查看文章红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）2007-12-07 11:42用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱1台*（存放抗原）3、振荡器1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法摘要：NDV是引起新城疫的病原体，新城疫又叫亚洲鸡瘟。
本病具有高度的传染性，发病急，致死率高。
对养禽业发展构成了严重威胁，是世界养禽业最重要的疾病之一。
为有效地控制新城疫病毒，对21日龄的1000雏鸡注射鸡新城疫灭活苗进行免疫，并对其抗体效价进行监测。
红细胞凝集试验和凝集抑制试验是监测鸡新城疫免疫状态的一种简便，快捷，经济的血清学方法。
次试验可作为监测鸡群免疫效果，疫苗使用效果和制定合理免疫程序的依据。
关键词：鸡新城疫抗体效价监测试验为掌握病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验的操作方法，对21日龄的1000只雏鸡注射了鸡新城疫灭活苗后9天，进行随机抽样检查。
作HI抗体滴度的测定，操作方法如：1.原理:NDV一个很重要的生物学特性就是能吸附于鸡，火鸡，鸭，鹅及某些哺乳动物（人，豚鼠）的红细胞表面，并引起红细胞凝集，而这种血凝现象能被NDV的抗体的抑制。
2.器材：2---5mL注射器、离心管、离心机、试管架、生理盐水、鸡新城疫疫苗弱毒Ⅳ系、1％鸡红细胞悬液。
3.操作步骤：①红细胞悬液的制作（0.7—1﹪）浓度低反应时间越长。
阿氏液：血液=1：1 肝素：血液=1：10取2mL阿氏液加2mL成年鸡血液于离心管中摇匀，放入离心机1500rPm,5min.吸取上清液及上层白细胞后加适量生理盐水混匀离心，重复三次，用生理盐水配成1﹪浓度。
②HA孔号(uL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12生理盐水50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘50鸡新城疫病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50振荡器上振荡1—2min. 18℃--22℃作用15min后观察结果。
结果# # # # # # # + ————结果表示病毒液的HA效价为27 ，HI时病毒Ag液50uL内须含4个凝集单位，测病毒Ag液作32倍稀释。
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生与维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，与时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备与监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原与盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
泰安市山农大药业有限公司血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能使一些特定的红细胞发生凝集现象。
当红细胞和病毒按适当的比例混合后，由于病毒的作用使红细胞发生凝集，此为凝集现象。
含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象的出现，即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，此为红细胞凝集抑制（HAI）。
微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法，也可以用于对一般人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。
用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新，用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清，可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别和亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清，由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高，易将不同毒株间抗原性差异显示出来，因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。
HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。
（一）生物安全要求所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。
季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3级实验室中进行。
（二）实验所用试剂1．标准参考抗原：以国际疫苗株和国内流行株作为标准参考抗原，新分离的毒株作为待测抗原。
2.标准参考抗血清：以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。
血清要经RDE处理。
（三）其他试剂/材料/仪器1. 红细胞悬液2. PH7.4的PBS缓冲液3. RDE（日本生研）4. 水浴箱（37℃，56℃）5. 台式离心机6. 多道可调加样器、单道可调加样器7. 离心管8. 96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）9. 200µL、1000µLTIP头、水槽表1. 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞火鸡豚鼠人“O”型血终浓度0.5 0.5 0.5 孔底部形状V型U型U型孵育时间25-30min 45-60min 45-60min 红细胞沉积形状细胞沉积成点状，倾细胞沉积细胞沉积成斜时细胞向下流成泪成环状环状滴状（四）流感病毒鉴定和抗原分析步骤1. 实验前准备（1）标准参考抗血清的处理1）去除血清中的非特异性抑制素a）所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。
目前所知道的非特异性抑制素，除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素，还有三种：α、β和γ。
在HAI试验中，必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净，才能准确地测定出HAI的抗体效价。
常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（RDE，受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。
b）RDE处理步骤：用25mL生理盐水稀释RDE；在1体积血清中加入3体积RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37℃水浴16-18h；56℃水浴30 min；加入6体积生理盐水（在0.4mLRDE和血清混合物中加入0.6mL生理盐水）。
2）去除非特异性凝集素a）向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。
b）完全/彻底混匀，在2-8℃孵育，每15 min重新混匀一次。
c）1h后，2000转离心5min。
吸出血清上清液。
d）取出一块96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS缓冲液,吸出50uL处理好的血清，做2倍稀释，加入50uL红细胞悬液，室温静置30-60min,观察试验结果，如果红细胞沉积，证明血清中非特异性凝集素去除干净（去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。
（2）红细胞悬液配制1） A.S液全称为Alsever氏液。
配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL，微热溶解，将pH值调到6.1，8磅20min高压灭菌，4℃贮存备用。
2）将含有红细胞的A.S液，离心5min（火鸡/鸡红细胞1800rpm；人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同），弃上清。
3）加入等量的PBS缓冲液洗涤，充分混匀，离心5min（转速同上），弃上清。
PBS缓冲液洗涤三次。
最后一次洗涤后，离心10min（转速同上），弃上清。
4）吸出适当体积的红细胞，用PBS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。
2. 流感毒株HA滴度的测定（1）在微量血凝板的第2~12列加入50µL PBS缓冲液。
（2）在第一列（A1~G1）中加入100µL病毒悬液。
（3） H1加入100µL PBS ，作为红细胞阴性对照。
（4） 从第一列各孔吸50µL 病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去50µL 。
（5） 在每孔中加入50µL 红细胞悬液，轻拍血凝板，充分混匀。
（6） 室温孵育，鸡和火鸡红细胞静置25-30min 后观察结果，人“O ”型和豚鼠红细胞45-60min 后观察结果，并记录。
3. HA 试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集，以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。
血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
表2. HA 滴度判定举例病毒稀释度 HA 滴度 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + - - - - - - - - - - 2 B + + + + - - - - - - - - 8 C + + + + + - - - - - - - 16 D + + + + + + - - - - - - 32 E + + + + + + + - - - - - 64 F + + + + + + + + - - - - 128 G + + + + + + + + + + + + ≥2048 H ------------＜14. 制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。
（2）制备4个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。
如每种血清做8孔稀释，每孔用抗原25µL，则测定一份血清需0.2mL抗原。
根据标准抗血清的份数计算出实验所需病毒抗原总量。
（3）其次，计算出病毒稀释度。
用病毒的HA滴度除以8，得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。
如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8，则1:8（1mL病毒液加7mLPBS缓冲液）稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。
注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25µL病毒液中含有4个血凝单位（等于50µL病毒液中含有8个血凝单位）。
表3. 所需抗原总量为1600µL时，4个血凝单位配置对照表HA滴度病毒液(µL) PBS(µL)16 800 80032 400 120064 200 1400128 100 1500256 50 1550512 25 15751024 12.5 1587.52048 6.25 1593.755. 4个血凝单位抗原的复核滴定（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。
操作方法同HA实验步骤。
（2）如果只有前4孔出现凝集，表明每50µL病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。
如第5孔也出现凝集，说明每50µL病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。
如只有前3孔凝集，表明每50µL病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。
此外，4个血凝单位抗原必须每次现用现配。
6. 红细胞凝集抑制试验（HAI）（1）利用HAI方法进行流感病毒的鉴定红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒，每块96孔血凝板可以检测两株未知病毒。
1）在血凝板的第1- 5、7-11列每孔加入25µL PBS缓冲液，第6和12列每孔加入50µLPBS。
然后在A1-A4、A7-A10各孔分别加入：抗A(H1N1)pdm09流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清25µL，用多道移液器从A1-A4、A7-A10行每个孔分别取25µL，由A至H行做2倍稀释血清，最后一行弃去25µL。
2）第1至4各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原1, A7至A10各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原2。
第5和第11列加入25µLPBS缓冲液，作为红细胞对照。
第6和第12列第一孔分别加入50µL8血凝单位待检抗原1和2，由A 至H行做2倍稀释，最后一行弃去50µL，此处做法的目的是HAI实验同时验证所配置4单位抗原的准确性,确保实验结果准确。
a）阳性对照：将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。
3）轻拍，混匀，室温孵育30min。
4）每孔加入50µL配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室温静置30-60min，观察血凝抑制实验结果（具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定，详见表1）。
（2）利用HAI方法进行流感病毒的抗原分析1）验证4血凝单位抗原步骤同以上，如果4血凝单位结果不准确需重新配置，直至回滴结果准确为止，在进行抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确，保证病毒之间抗原分析结果有可比性。
2）在微量血凝板的第1-11列每孔加入25µLPBS缓冲液，第12列每孔加入50µLPBS缓冲液。
在第一行（A1-A11）每孔加入25µL对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清。
3）从第一行（A1-A11）各孔混匀之后吸取25µL血清，由第1行至第8行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去25µL液体。
4）在微量板的第1-11列每孔加入25μL配制好的4血凝单位抗原，第12列A12孔加入50µL配置好的8血凝单位抗原，由第1行至第4行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去50µL液体。
