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血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

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血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料

血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料

2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸

血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)

血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
病毒的血凝试验（HA）及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
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1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高

实验一-鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

实验一-鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

鸡新城疫血凝（HA)和血凝抑制(HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒（如新城疫病毒,禽流感病毒等）能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象（HA)。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI）。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只,被检鸡15—25只.器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0。

025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1)浓缩抗原;（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液;（4）红细胞悬液;(5）待检血清4．实验步骤（1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

（2）诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高,即有诊断意义。

（3)免疫机体抗体效价的测定：3。

鸡新城疫(ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原,进行试验。

② 0.7%细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂）内，迅速混匀.如当时不用,可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份,血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5—10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水）洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清,再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液（0。

血凝及血凝抑制实验

血凝及血凝抑制实验
注意事项
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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血凝、血凝抑制试验

血凝、血凝抑制试验

⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。

5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。

清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。

3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。

在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。

放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。

使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。

现⽤现配。

4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。

5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。

红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)

红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。

但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。

因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。

通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。

因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。

下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。

一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。

清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。

血凝和血凝抑制实验

血凝和血凝抑制实验

实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。

四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。

红细胞凝集试验(HA)

红细胞凝集试验(HA)

用户名: 密码: 登录注册畜牧兽医知识的天堂主页博客相册|个人档案|好友查看文章红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）2007-12-07 11:42用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。

但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。

因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。

通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。

因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。

下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。

一、实验用设备：1、离心机1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱1台*（存放抗原）3、振荡器1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。

清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

血凝和血凝抑制实验

血凝和血凝抑制实验
8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底 要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验 中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝 这种情况。
注意事项
9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为 12。原因分析：1、 4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环 境温度过高；3、读数时间拖延；4、没有加4个单位抗原。
6、结果判定。将反应板倾斜60°，观察红细胞有无 泪滴状流淌，完全凝集无泪珠状流淌（100%）的最 高稀释倍数为抗原血凝价。
抗原效价测定
12345
67
8
9
10
11 12
2 4 8 16 32 64 128 ×××× × × ×
生 25 25 25 25 25
理 盐 水
抗 25 25 25 25 25
H7亚型禽流感 血凝抑制试验
鲜海梅
内容
1、血凝试验(HA)：检测抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)：检测抗体 3、注意事项
材料
1、90°的96孔微量反应板、单道及多道微量移液器、吸头、加样槽、烧 杯、吸管、量杯、微量振荡器；
2、H7亚型禽流感抗原、阴阳性血清、稀释液（PBS）；
实验原理
1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地 使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的 现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞 不流淌）。
阿氏保护液配制：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠 0.8克，柠檬酸（枸橼酸 ）0.055克，氯化钠 0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后 调PH值至6.1，然后高压灭菌15分钟，2-8° 保存备用
3.8%抗凝剂配制：枸橼酸钠3.8克，加入蒸馏 水100毫升。

HA-HI试验

HA-HI试验

8、判定结果
（1）血清抗体效价的判断：
能够使4单位病毒凝集鸡红细 胞的作用完全被抑制的血清最 高稀释倍数，称为该血清的抗 体效价，以2的指数表示。
孔号： 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11ห้องสมุดไป่ตู้
12
上图，血清抗体效价依次为28、 27、28、29、28、27、27、26
2、判定标准：
（1）一般认为鸡的免疫临界水平 为25（成鸡）或26（雏鸡）。 （2）鸡血清的凝集抑制价，全部 高于26可适当推迟新城疫免疫时间， 全部低于24以下，应马上进行新城 疫疫苗接种。
血清稀释倍数
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 稀释 倍数
21
22
23
24
25
26
27
28
29
210
211 对 照
3、加4单位抗原
1~12孔各加25微
升。 4、置于振荡器上，振荡1分钟，室 温静置 20分钟。 5、加1%的鸡红细胞悬液 用微量 移液器向1~12孔各加1%红细胞悬 液25微升。 6、置于振荡器上，振荡1分钟。室 温静置20~25分钟后观察结果。

1%红细胞悬液制备


1、抗凝血的制备 采集3只非免疫成年健康鸡血液， 由翅静脉或心脏采血，按3.8%柠檬酸钠与血液1：4 混合制成。 2、1%红细胞悬液制备 将抗凝血加入离心管内， 用生理盐水洗涤5次，每次2000r/min离心5min ， 将血浆、白细胞充分弃去，最后一次离心时间为 10min，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红 细胞体积，用生理盐水配制成1%红细胞悬液。

血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

B
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2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡， 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与 阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃 上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分 钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过 程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过 5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离 心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管 中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红 细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS， 混合均匀即可。

实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。

如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。

血凝HA和血凝抑制试验HI

血凝HA和血凝抑制试验HI

HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
02
血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
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1、注意抗原相的差异
2、注意消除非特异性因素
禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非 特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制 试验时会出现2-3孔有凝集现象。 因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测 定之前，有必要对血清中非特异性因子进行 排除。
常用消除方法（FAO推荐）
1、鸡的红细胞吸附法 1.1试剂 鸡的红细胞：要充分洗涤； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 1.2方法 加入25µL鸡的红细胞到100µL血清中； 4℃，用微量振荡器振荡20-30min； 加入100µL灭菌PBS (用RDE处理的血清除外)； 4000转离心1min； 取出上清，进行HI试验； 用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性 用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
3、 热灭活法
3.1鸡血清 取100µL血清样品放入一灭菌离心管中； 各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭菌离心管 中； 56℃水浴30min。 3.2 其它禽类血清 血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、阳性血 清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水浴30min。 热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异 性抗体破坏较大。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL， 散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压 灭菌，4℃保存备用。
2 1%鸡红细胞液的制备
2.2原理 特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝 集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用
1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知 病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知 的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集 红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体 内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞， 并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该 病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳 性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么， 这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液 虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制， 说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。
1.3 原理 血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如: 痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。 流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI) 2.1定义 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的 试验方法。
四、注意事项
目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问 题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而 导致不正确的结果。
实践中，经常会出现不同厂家生产的相同亚型的 禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，这 是由于禽流感病毒变异较快，存在抗原相的差异。 禽流感病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和 力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清 均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株 低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。 如果在试验中出现相的差异，所测结果会相差23个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲 和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的 灵敏度 。
3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾 斜（45度左右），观察血凝板，判读结果： ++++：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细 胞凝集 ＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 ＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块 ＋： 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 －：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细 胞完全不凝集 能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最 高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位 （HAU）。 注意！ 对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次 检验无效
3、对禽群的免疫状态进行评价
禽群或个体血清中的HI抗体水平与疫苗的免疫和对相应强毒侵袭的抵 抗力都有密切关系。以新城疫为例，当HI抗体在7Log2以上进行活苗 免疫时，由于高抗体可中和绝大部分的疫苗病毒，产生的免疫力很弱； HI抗体在5Log2～6Log2时，活苗免疫效果也受到一定的干扰；当HI抗 体在4Log2以下时，活苗免疫效果良好，但对强毒感染抵抗力下降。 一般认为，成年鸡新城疫的HI抗体水平在5Log2以上时，保护率在90 ％以上，4Log2以下时只有50％的鸡对强毒有抵抗力，2Log2以下时80 ％以上的鸡易感染新城疫。 由于雏鸡母源抗体对疫苗首次免疫效果影响很大，了解母源抗体水平 对疫苗免疫有重要意义。研究表明，母鸡血清抗体、卵黄抗体和5日 龄雏鸡母源抗体三者之间有相关性，卵黄抗体与母鸡血清抗体基本一 致，而1日龄雏鸡血清抗体低于卵黄抗体一个滴度，可检测种鸡卵黄 抗体、估测1日龄雏鸡母源抗体水平。 雏鸡新城疫母源抗体半衰期约 为5天，免疫临界点为3Log2，这样可依据抗体水平，确定最佳免疫时 间。
2、RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注意避 免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用255µL鸡的红细胞到500µL血清中；4℃，用微量振荡器振荡2030min；4000转离心1min。
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高达 11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈正态 分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1％以下。 而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以上者占25％ 以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽群的抗体水平 高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊断禽群是否患 有新城疫或禽流感等。
血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）
主要内容
一、基本概念 二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用 三、基本操作 四、注意事项
一、基本概念
1、血凝试验(HA) 1.1 定义 某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某 几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现 象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 。 常见于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和 某些黄病毒（如JEV）、痘病毒、以及经过处理过 后的IBV。
1.2 血凝类型： (1) 可逆转型 血凝素与病毒颗粒易分开，经超速离心后， 病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清 液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆 的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的 血凝素后，可再与该血凝素发生凝集。 如天花、鼠疫等病毒。
(2) 不可逆转型 血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处 理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红 细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度 (37℃) 下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键 的N-乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游 离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集 病毒的能力。 如流感病毒、鸡新城疫病毒等。
3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）
3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。 3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3 孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴 头。 3.4每孔再加入25μL PBS。 3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液 充分摇匀后加入） 3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静臵40min后观察结果（如 果环境温度太高，可臵4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将 呈明显的钮扣状沉到孔底。
பைடு நூலகம்
(3) 凝集条件严格型
有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格，不 仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即是对同 种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集 性能亦有差异（如JEV对公鹅的红细胞凝集性能比 对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好） 。除此之 处，还对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均 很严格。
4、血凝抑制试验（HI试验 微量法）
4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍 数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如 果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。 4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS。 4.3 吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次对倍 稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。 4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温（约20℃）静 臵至少30min。 4.5 每孔加入25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静臵约 40min（室温约20℃，若环境温度太高可臵4℃条件下进行），对照红细胞 将呈现钮扣状沉于孔底。 4.6 结果判定 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴 度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于 31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。