测定枯草芽孢杆菌生产中温α-淀粉酶方法的研究

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化摘要：以枯草芽孢杆菌（B.subtilis HN503）的基因组 DNA 为模板,运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。

SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化，PAGE进行纯度鉴定。

1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据1.1.1α-淀粉酶及其应用α- 淀粉酶(α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，是一种重要的淀粉水解酶。

它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4 葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取，而工业中主要应用的是真菌和细菌α- 淀粉酶。

目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶[1]。

α- 淀粉酶在淀粉工业中的应用。

α- 淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产, 主要用于淀粉的糖化和液化，其水解产物如葡萄糖和果糖有着高甜度，被广泛用于饮料工业中软饮料的甜味剂。

在冷饮制作中，由于淀粉糊具有老化的物理性质，低温静置会形成不溶性的硬性凝胶块，影响冷饮的质量及口感。

α-淀粉酶的加入，能很快将淀粉水解到糊精和低聚糖范围大小的分子,使料液粘度急速降低，流动性增高,从而保证了高淀粉冷饮的质量,使其在口感上更适合于人们的需要。

工业生产中, 淀粉的液化是将α- 淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化[2-3]。

α- 淀粉酶在焙烤工业中的应用。

α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品行业,适量的α-淀粉酶可改良面包品质,用于面包工业[4]。

α- 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大, 纹理疏松; 提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构, 增加内部组织的柔软度; 产生良好而稳定的面包外表色泽; 提高入炉的急胀性; 抗老化, 改善面包心的弹性和口感; 延长面包心储存过程中的保鲜期[5]。

α淀粉酶（中温）使用要领及效率之阳早格格创做导读：α淀粉酶（中温）是采与劣良菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）经液体深层收酵、粗制而成的下效死物制剂，广大应用于啤酒等死产中.产品个性淀粉酶为火解酶类，能正在较下温度下随机火解淀粉、糖本及其落解物里面的α1.4葡萄糖苷键，爆收可溶性糊粗战少量矮散糖，使得胶状淀粉溶液的粘度赶快下落，过分火解可爆收少量葡萄糖战麦芽糖.酶活力单位的定义1mL液体酶，于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/mL表示.效率条件温度： PH值：最适温度范畴：70℃～75℃；最适pH范畴：5.0～6.0；灵验温度范畴：60℃～85℃. 灵验pH范畴：5.0～7.0.效率成果使淀粉液化更真足，醪液分层更明隐，色度矮，收缩糊化战过滤时间，普及设备战本料利用率；可真止无麦芽糊化支配，以普及辅料比率，进而落矮啤酒死产成本，革新啤酒本量，普及经济效率.规格及尺度淀粉酶为浅褐色液机制剂，酶活力≥3,000u/mL，果收酵本料、周期等果素的效率，颜色会稍有好别，但是没有会效率使用成果.本产品切合国家尺度GB8275《食品增加剂α淀粉酶制剂》.本产品切合食品仄安国家尺度GB2760《食品仄安国家尺度食品增加剂使用尺度》战GB25594《食品仄安国家尺度食品工业用酶制剂》的相闭确定.使用量正在啤酒酿制历程中，使用辅料时，推荐加量为辅料搞沉的0.04~0.08%（即每吨辅料加进0.4~0.8L），与α淀粉酶（耐下温）拆配使用效验更好；然而，由于糖化本料组成及工艺参数的好别，本品的最好增加量应通过正在糖化车间中举止分歧增加量的考查去决定.如果工艺中需安排料液的pH，请正在安排完毕后再加进酶液.使用仄安酶制剂是蛋黑量，吸进灰尘或者悬浮微粒大概会爆收过敏效率，引导人们爆收过敏反应.如果万古间交触某些酶，大概会刺激皮肤、眼睛战粘膜；飞溅战热烈搅动大概制成可吸进的粉尘.修议脱戴具备呵护效率的衣服、脚套战眼睛或者脸部呵护物.储藏淀粉酶属死物活性物量，应置于矮温、搞燥处保存，预防阳光曲射及少久与中界交触.本产品本启拆正在15℃以下矮温阳凉搞燥环境，保量期12个月。

１０科技创新导报　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ研　究　报　告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。

α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。

目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。

我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。

现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。

总产量上万吨。

近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。

但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。

本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。

１　材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。

１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。

１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。

a-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达耐高温a-淀粉酶是食品工业中应用最普遍的酶种之一,广泛应用于啤酒、酒精、味精及淀粉工业等领域[1]。

其适用pH范围为6~7,在酸性条件下其酶活明显降低,不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求,因此对耐酸性a-淀粉酶的需求日益上升。

20世纪90年代以来国外已陆续有耐酸性a-淀粉酶的研究报道[2,3]。

而我国的a-淀粉酶品种较单一,目前还未见相关报道。

枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点,被认为是表达和分泌异源蛋白的理想受体[4]。

但外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达水平一般比大肠杆菌低,原因之一是由于枯草芽孢杆菌可向胞外分泌高浓度的蛋白酶,以致影响了表达产物的稳定性。

而DB403是三蛋白酶缺陷菌株,有助于提高分泌蛋白的稳定性。

另外某些外源基因的表达产物对宿主存在一定的毒害作用。

构建诱导型分泌表达系统可将宿主菌的生长与外源蛋白的表达两个过程分开,是克服这个问题的重要途径之一。

芽孢杆菌的sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,此胞外酶的表达受蔗糖诱导[5]。

本研究中将地衣芽孢杆菌的耐高温a-淀粉酶基因进行耐酸性改造,利用获得的sacB基因的启动子-信号肽序列(称为sacR)构建诱导型分泌表达载体,并实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

为耐酸性a-淀粉酶的工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法1.1 菌株和质粒E.coli菌株BL21(De3),JM109,Bacillussub2tilisDB403(HisnprR2,npre18aprA)由本实验室保存;质粒peT-22b,购自NOVAGeN公司(含T7启动子的高效表达载体);大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBe2,由天津大学赵学明教授惠赠;质粒pSA60含有枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子信号肽序列,由中山大学罗进贤教授惠赠;质粒peTAM含有地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因,由本实验室构建。

peTAM是由peT-22b的上游和下游分别被NdeI和HindIII酶切后与经同样双酶切的a-淀粉酶基因连接构建而成。

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。

为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。

淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。

而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。

本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。

目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。

方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。

结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。

实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。

展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。

首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。

其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。

此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。

结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。

这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。

枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。

通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。

总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010665839.2(22)申请日 2020.07.12(71)申请人 广东溢多利生物科技股份有限公司地址 519060 广东省珠海市南屏科技工业园屏北一路8号(72)发明人 陈稳　李阳源　刘金山　唐鸣雷　王勇　钟倩慧　邓敬阳　(74)专利代理机构 北京法信智言知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11737代理人 刘静荣(51)Int.Cl.C12N 9/28(2006.01)C12N 15/75(2006.01)C12N 15/113(2010.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用(57)摘要本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α‑淀粉酶的方法、重组启动子以及应用。

本发明提供了一系列能高效表达耐高温α‑淀粉酶的组合启动子和信号肽，相对于对照启动子和信号肽组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α‑淀粉酶相对酶活均有一定的提高，杂合启动子与不同信号肽组合的高温α‑淀粉酶酶活力提高幅度更大，为工业化生产耐高温α‑淀粉酶奠定了基础。

权利要求书1页 说明书7页序列表8页 附图1页CN 111808834 A 2020.10.23C N 111808834A1.在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述包括以下步骤：构建蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌作为表达宿主；构建包含启动子和信号肽和高温α-淀粉酶基因的重组表达载体；将上述构建的重组表达在于转入所述蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌中，进行发酵培养，获得耐高温α-淀粉酶去，其中，所述启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的单启动子，或者，所述启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的单启动子中的两个或多个组成的杂合启动子，所述信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。

枯草杆菌生产α-淀粉酶摘要：α-淀粉酶广泛应用于生产生活的各个方面，并且枯草杆菌生产技术也已经拥有相当成熟的工业生产线。

但随着社会的发展，对α-淀粉酶的生产也提出来更高的要求。

本文着重介绍枯草杆菌生产α-淀粉酶生产流程以及最新的最新研究进展。

关键词：枯草杆菌α-淀粉酶基因工程菌筛选1、α-淀粉酶：1.1理化性质：米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH 值范围 5.5~7.0，最适pH 值为6.01.2化学性质：α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。

2、枯草芽胞杆菌：2.1细胞及菌落形态：枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

2.2产α-淀粉酶机制2.2.1机制一：枯草杆菌含有α-淀粉酶基因，通过基因的转录表达可以产生α-淀粉酶。

为了提高枯草杆菌的产酶能力，物理方法(射线和紫外线等)和化学方法(亚硝酸胍)常被用于诱变育种，其产酶能力提高一般5—6倍。

2.2.2机制二：利用基因工程的手段将枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因导入基因工程菌内并得到表达，提高产酶能力。

3、α-淀粉酶工业生产流程：3.1菌种的初筛复筛及优化3.1.1初筛：将土壤样品10g放入带有玻璃珠盛有100ml无菌水的三角瓶中。

枯草杆菌α-淀粉酶的生产-回复枯草杆菌是一种常见的土壤细菌，它具有广泛的生态功能和应用潜力。

其中，枯草杆菌所产生的α淀粉酶具有重要的工业应用价值。

本文将重点介绍枯草杆菌α淀粉酶的生产过程，并一步一步回答相关问题。

第一步：枯草杆菌的筛选和培养枯草杆菌存在于自然环境中，但数量相对较少。

因此，首先需要对土壤、水体等样品进行筛选，以获得富集了枯草杆菌的样品。

一般来说，筛选方法包括稀释平板法、滤膜法等。

将样品分别稀释后接种到富含淀粉的培养基上，通过观察形状、颜色等特征，选择出生长较好的菌落。

筛选获得枯草杆菌后，需要进行培养。

枯草杆菌的培养基一般包括有机氮源、无机盐和适度的碳源。

常用的培养基主要有液体培养基和固体培养基。

液体培养基的优点是便于大规模生产，而固体培养基适用于纯化和保存菌株。

第二步：对枯草杆菌的生理特性进行研究在获得培养好的枯草杆菌后，需要进一步研究其生理特性，了解其适宜生长条件和产酶规律。

主要考察的因素包括温度、pH、碳源和氮源等。

通过调整这些因素，可以获得最佳的生长条件，提高α淀粉酶的产量。

第三步：淀粉诱导条件的优化淀粉是枯草杆菌产生α淀粉酶的主要诱导物。

在培养基中添加适量的淀粉，并对其浓度、添加时间和添加方式等进行优化。

一般来说，较高的淀粉浓度和适当的诱导时间可以促进α淀粉酶的合成和分泌。

第四步：分离和纯化α淀粉酶枯草杆菌培养物中产生了大量的α淀粉酶，但还同时存在其他杂质和细胞碎片等。

因此，需要对培养物进行分离和纯化，以得到纯度较高的α淀粉酶。

分离和纯化方法主要有凝胶过滤、柱层析、凝胶电泳等。

其中，柱层析常用于大规模生产，通过调节柱层析的条件（例如树脂种类、流速等），可以将α淀粉酶与其他杂质分离。

第五步：对纯化后的α淀粉酶进行特性研究分离和纯化后的α淀粉酶需要进行特性研究，了解其催化特性、抗温性和酸碱稳定性等。

这些特性研究有助于评估α淀粉酶在不同工业应用中的潜力和适用性。

除了以上步骤，还可以利用遗传工程手段对枯草杆菌的基因进行改造，提高α淀粉酶的产量和活性。

实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应（一）目的要求通过实验观察硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌的诱变效应。

初步掌握化学诱变育种的方法。

（二）基本原理许多化学因素如硫酸二乙酯、亚硝酸等，对微生物都有诱变作用。

硫酸二乙酯是一种烷化剂，能与DNA中碱基发生化学变化，从而引起DNA复制时碱基配对的转换或颠换。

一般化学诱变剂都有毒性，很多还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取，并防止与皮肤直接接触。

中止反应时，可以用大量稀释法或加入硫代硫酸钠。

本实验以产生蛋白酶的枯草芽孢杆菌为实验菌种，以硫酸二乙酯为诱变剂，根据枯草芽孢杆菌诱变后在培养基上出现的透明圈直径大小，来指示诱变效应。

（三）实验材料1. 菌种酶泥（菌悬液）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基＋0.5％可溶性淀粉（牛肉膏0.5%，蛋白胨1％，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%，pH7.0－7.2）。

3. 主要药品硫酸二乙酯(简写DES，(C2H5)2SO4)、25％硫代硫酸钠。

4. 器皿试管、移液管、锥形瓶、培养皿、离心管、玻璃涂棒、量筒、烧杯等。

（四）实验步骤1. 诱变前的准备工作1）菌种斜面的活化从冰箱取一支纯化后的枯草芽孢杆菌1.398斜面接种到新鲜肉膏蛋白胨斜面培养基上，置于30℃温箱培养24h进行活化。

2）枯草芽孢杆菌对数期培养液的制备取一环已活化的枯草芽孢杆菌接种到装有30 ml肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶内(每组同学2瓶)，在30℃振荡培养16h，此时为该菌的对数期。

3）准备平板将装在锥形瓶内已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷至45℃左右倾注10个平板待用。

4）菌悬液的制备取上述对数期的枯草芽孢杆菌培养液10 m1，3000 r/min 离心15 min ，沉淀下的菌体用10 ml 0.1mo/LpH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。

2. 硫酸二乙酯诱变处理 1）诱变吸取1 ml 菌悬液至盛有8ml 无菌水的试管内，再加硫酸二乙酯0.5 ml ，振荡处理5 min 。

α-淀粉酶中温使用方法及作用导读：α-淀粉酶中温是采用优良菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis经液体深层发酵、精制而成的高效生物制剂,广泛应用于啤酒等生产中;产品特性淀粉酶为水解酶类,能在较高温度下随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α葡萄糖苷键,产生可溶性糊精和少量低聚糖,使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降,过度水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖;酶活力单位的定义1mL液体酶,于60℃、pH=条件下,1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量,即为1个酶活力单位,以u/mL表示;作用条件温度： PH值：最适温度范围：70℃～75℃；最适pH范围：～；有效温度范围：60℃～85℃; 有效pH范围：～;作用功效使淀粉液化更彻底,醪液分层更明显,色度低,缩短糊化和过滤时间,提高设备和原料利用率；可实现无麦芽糊化操作,以提高辅料比例,从而降低啤酒生产成本,改善啤酒品质,提高经济效益;规格及标准淀粉酶为浅褐色液体制剂,酶活力≥3,000u/mL,因发酵原料、周期等因素的影响,颜色会稍有差异,但不会影响使用功效;本产品符合国家标准GB8275-2009食品添加剂α-淀粉酶制剂;本产品符合食品安全国家标准GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准和GB25594-2010食品安全国家标准食品工业用酶制剂的相关规定; 使用量在啤酒酿造过程中,使用辅料时,推荐加量为辅料干重的~%即每吨辅料加入~,与α-淀粉酶耐高温搭配使用效果更佳；然而,由于糖化原料组成及工艺参数的差异,本品的最佳添加量应通过在糖化车间中进行不同添加量的试验来确定;如果工艺中需调整料液的pH,请在调整完成后再加入酶液;使用安全酶制剂是蛋白质,吸入灰尘或悬浮微粒可能会产生过敏作用,导致人们产生过敏反应;如果长时间接触某些酶,可能会刺激皮肤、眼睛和粘膜；飞溅和强烈搅动可能造成可吸入的粉尘;建议穿戴具有保护作用的衣服、手套和眼睛或脸部保护物;储存淀粉酶属生物活性物质,应置于低温、干燥处保存,避免阳光直射及长期与外界接触;本产品原封装在15℃以下低温阴凉干燥环境,保质期12个月。

α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。

二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。

然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。

4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。

配好后用pH计校正。

（二）仪器1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。

通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2. 测定（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。

利用枯草芽孢杆菌生产中温淀粉酶发酵条件的优化研究毕静;薛茂云;杨爱萍;马美华;郑萍【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】为了进一步研究枯草芽孢杆菌发酵产中温淀粉酶的工艺条件,在前期经过菌种筛选及诱变育种得到一株高产中温淀粉酶的枯草芽孢杆菌,并通过摇瓶发酵实验初步确定了在影响该菌株发酵产酶的主要营养因素及环境条件的基础上,以枯草芽孢杆菌为发酵菌,通过三因素三水平正交实验法对枯草芽孢杆菌的5L发酵罐发酵产酶条件进行优化。

实验结果表明：枯草芽孢杆菌产中温淀粉酶的最优发酵条件为：接种量10%、初始发酵pH 值为6、玉米粉与豆饼粉之比为3.5∶1、培养温度37℃,接种种龄20 h、转速为450 r/min、通风量为1 vvm和发酵时间65 h。

经过三批发酵实验验证,最优条件下中温淀粉酶最高酶活达到6907 U/mL。

【总页数】3页(P49-51)【作者】毕静;薛茂云;杨爱萍;马美华;郑萍【作者单位】江苏经贸职业技术学院，南京 211168;江苏经贸职业技术学院，南京 211168;江苏经贸职业技术学院，南京 211168;江苏经贸职业技术学院，南京211168;江苏经贸职业技术学院，南京 211168【正文语种】中文【中图分类】TS201.25【相关文献】1.响应面法优化枯草芽孢杆菌发酵产低温淀粉酶的工艺条件 [J], 库米拉·马吉提;王伟;张晓燕;李静;闫婷婷;刘洋;武运2.中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化 [J], 张士彬;陈景奇;崔艳艳;谢能中;王敏;张大伟3.枯草芽孢杆菌工程菌产中温α-淀粉酶发酵条件优化 [J], 孙静;路福平;刘逸寒;刘曦;肖静4.枯草芽孢杆菌产淀粉酶培养条件的优化研究 [J], 陆雯;刘杰雄;刁萍萍;陈号;朱丽云5.枯草芽孢杆菌突变株XLG-51产中温α-淀粉酶发酵条件优化 [J], 张旦旦;李文秀;史劲松;许正宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验一、实验原理以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

二、实验材料（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（二）培养基：1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl20 .02 % 、MgSO40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K2HPO40 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、Na2HPO40 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管三、实验过程1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。

产а-淀粉酶的枯草杆菌的筛选与产酶条件的研究1 引言枯草芽孢杆菌（B.S）属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，无荚膜，需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，是a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。

淀粉酶属于水解酶的一种，是淀粉水解的生物催化剂。

按降解方式分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环糊精生成酶。

α-淀粉酶以无规则的方式切断淀粉大分子内部的α-1，4糖甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因产物的末端葡萄糖残基中碳原子为α-构形，故称为α-淀粉酶。

大多α-淀粉酶(个别品种除外)不能切断α-1，6糖甙键，也不能切断分支点附近的α-1，4糖甙键。

目前，α-淀粉酶在我国产量较大，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域。

用α-淀粉酶水解淀粉时，要注意水解条件。

影响α-淀粉酶活性的主要因素有pH值、温度和金属离子[1]。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。

对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵。

因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[2]。

2 文献综述2.1 α-淀粉酶及其性质2.1.1 α-淀粉酶α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物，其国际酶学分类编号是EC．3.2.1.1，它作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。

现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶[1]。

2.1.2 α-淀粉酶的性质一般α-淀粉酶在pH值为5.5-8.0时活性较稳定，pH小于4时，酶易失去活性。

但有些α-淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的α-淀粉酶最适合的pH为4，在pH 为2.5、温度为40℃处理30min后仍有一定的活性，但在pH为7、温度为55℃处理15min，α-淀粉酶几乎失活。

20L全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉酶实验实验时间：2012年6月17日—2012年6月28日学生姓名：xxxxxx学号：院系：生命学院专业：生物技术指导教师：2012年6月30日目录一. 实验目的要求 (4)二、实验试剂和仪器 (4)1、种子培养基：57＃培养基 (5)2、发酵培养基 (5)3、发酵过程中相关参数的测定 (6)三、实验步骤与方法 (6)1、了解发酵罐系统的结构 (6)2、种子培养 (6)3、发酵罐空消 (6)4.PH电极与DO电极的首次校正 (8)5、发酵培养基的配置 (9)5.1 培养基摇瓶试验 (9)5.2 种子的摇瓶 (9)6.装料 (10)7、实消 (10)8.PH电极与DO电极的再次校正 (10)9、接种 (11)10、设定发酵参数，运行发酵指令 (11)11、发酵过程中相关参数的记录 (11)12、发酵过程中取样及相关参数的测定 (12)（1）参数测定所需的溶液的配置 (12)（2）取样 (13)（3）样品处理 (13)（4）残糖含量测定（DNS法） (13)（5）生物量的测定（比浊法） (14)（6）淀粉酶发酵活力的测定 (14)（7）葡萄糖标准曲线的制作 (15)（8）麦芽糖标准曲线的制作 (15)13. 放料,清洗罐体，空消，保养 (16)四、实验结果与讨论 (17)五. 实验心得体会 (26)一、实验目的要求：1.掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构(1)发酵罐主体(2)蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作(3)通气系统(4)加热冷却循环系统：各管道联络关系(5)搅拌动力系统(6)智能控制系统2.掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，参数设定3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。

4.运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律。

二、实验试剂和仪器1、种子培养基：57＃培养基试剂及药品：麸皮50g豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30gNaCl 2 g蒸馏水、斜面培养的枯草芽孢杆菌器材：1000ml烧杯、玻璃棒、100ml锥形瓶（20个）、天平、粉碎机、电热炉、高压灭菌锅、灭菌枪头、1000移液枪、酒精灯、75%酒精、棉球、无菌操作台、封口膜、橡皮筋、恒温摇床、1000ml锥形瓶、标签纸2、发酵培养基：试剂及药品：麸皮（3％）320g12水磷酸氢二钠（0.2％）70.55g硝酸钾（0.2％）28g消泡剂（植物油）（0.3％）42g蒸馏水器材：1000ml烧杯、玻璃棒、75%酒精、棉花、一次性口罩、打火机、厚手套、天平3、发酵过程中相关参数的测定的药品、仪器：试剂及药品：无水葡萄糖0.1gNaOH 4g3水乙酸钠0.6804g淀粉1g乙酸、蒸馏水、DNS、PH标准缓冲液、亚硫酸钠器材：10mL具塞刻度试管（30个）、100ml容量瓶（2个）、200ml 容量瓶（2个）、100ml烧杯、100ml试剂瓶（4个）、100ml锥形瓶（2个）、玻璃棒、1000ml烧杯、标签纸、电热炉、木夹、试管架、PH标准试纸、PH计、枪头、1000移液枪、恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、烘箱、冰箱、上海高机SY-3000发酵系统三、实验步骤与方法1、了解发酵罐系统的结构（1）．罐体（2）．发酵罐的搅拌系统（3）．空气供给系统（4）．温度控制系统（5）．pH控制系统（6）．过程变量的测量（7）．灭菌系统（8）测量及控制系统：下位机、上位机、网络通讯2、种子培养（1）称取麸皮50g、豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30g（用粉碎机搅碎为粉末）,上述成分混合于1000ml烧杯中，加NaCl 2 g、蒸馏水1.0L 置于电热炉上煮沸1小时，将pH 自然，待温度下降后分装入20个100ml 锥形瓶中，每瓶30ml。