枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶实验方案

α－淀粉酶的生产工艺
食品111 陈雅媚 14号
目的：
学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。
α－淀粉酶的背景知识
α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中， 能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄 糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之 一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及 淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发 酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以 BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出 了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的 生产工艺。
3 4 5 6 7
可溶性淀粉溶液 温度条件和 保持时间 斐林试剂 温度条件和 保持时间
2ml
煮沸 1mil
有砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
实验现象
The end
谢谢 本次课程到此结束
取三支洁净试管，编上号，并分别按下表中序号1至5要求操作。
序 号 1
项
目
试
管
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
可溶性淀粉溶液
1 2ml
60º C热水
2 2ml
沸水
3 2ml
冰块
2
3 4 5
温度条件 (保持5min)
新鲜淀粉酶溶液 （保持5min） 碘液（滴）
1ml 1
不变蓝
1ml 1
变蓝
1ml 1
变蓝
实验现象
二、PH对酶活性的影响
4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间， 物质的添加无法达到均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多 工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应 器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。

１０科技创新导报　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ研　究　报　告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。

α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。

目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。

我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。

现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。

总产量上万吨。

近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。

但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。

本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。

１　材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。

１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。

１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。

从枯草杆菌发酵液中提取a淀粉酶的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。

为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。

淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。

而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。

本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。

目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。

方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。

结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。

实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。

展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。

首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。

其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。

此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。

结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。

这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。

枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。

通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。

总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。

试剂及溶液
试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬 酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公 司）。
溶液配制： 原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水 使碘完全溶解，定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液2.00 mL，加20.0 g碘化钾用 水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。
酶的比活力
酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条 件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的 酶活力单位数。 酶活力：样品中酶总共有多少个酶单位。 比活力：每mg蛋白质中有多少个酶单位。 酶比活力＝酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA） 可用以比较每单位质量酶蛋白的催化能力。 对同一种酶，比活力可以代表酶的纯度，比活力 愈高，表示酶愈纯。在酶纯化过程中，比活力增 高。
4、菌种的制备：将斜面菌种在无菌条件下接种至 液体种子培养基中，在一定温度、转速下培养。
5、发酵：将摇床培养好的种子培养液接入发酵培 养基中，接种量为5 mL，共接3 瓶（100ml/250ml 瓶），做好标记。
实验步骤
发酵结束后：检查是否染菌 固液分离：方法自定； 发酵结束时，显微镜检查每个发酵瓶是否 污染，若无污染合并发酵液并测定发酵酶 活力。
α-淀粉酶制剂的理化要求
α-淀粉酶制剂的卫生要求
三、实验内容
微生物发酵法是酶制剂生产的主要方法。发酵生 产中多用液体深层发酵法制备酶。 大规模液体深层发酵之前，首先在实验室对保藏 的目的菌种进行活化和扩大培养，制得生产种子。 扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一 定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进 行恒温培养。 摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的 一种模拟实验。（摇瓶发酵生产α-淀粉酶）

a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37C,24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

枯草杆菌生产α-淀粉酶摘要：α-淀粉酶广泛应用于生产生活的各个方面，并且枯草杆菌生产技术也已经拥有相当成熟的工业生产线。

但随着社会的发展，对α-淀粉酶的生产也提出来更高的要求。

本文着重介绍枯草杆菌生产α-淀粉酶生产流程以及最新的最新研究进展。

关键词：枯草杆菌α-淀粉酶基因工程菌筛选1、α-淀粉酶：1.1理化性质：米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH 值范围 5.5~7.0，最适pH 值为6.01.2化学性质：α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。

2、枯草芽胞杆菌：2.1细胞及菌落形态：枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

2.2产α-淀粉酶机制2.2.1机制一：枯草杆菌含有α-淀粉酶基因，通过基因的转录表达可以产生α-淀粉酶。

为了提高枯草杆菌的产酶能力，物理方法(射线和紫外线等)和化学方法(亚硝酸胍)常被用于诱变育种，其产酶能力提高一般5—6倍。

2.2.2机制二：利用基因工程的手段将枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因导入基因工程菌内并得到表达，提高产酶能力。

3、α-淀粉酶工业生产流程：3.1菌种的初筛复筛及优化3.1.1初筛：将土壤样品10g放入带有玻璃珠盛有100ml无菌水的三角瓶中。

淀粉酶发酵制备一、实验目的1.学习并掌握从大曲中分离产淀粉酶菌种的方法1．学习并掌握液体摇瓶发酵法制备α-淀粉酶的工艺；2．掌握α-淀粉酶酶活测定原理及方法。

二、实验原理α-淀粉酶生产菌主要有芽孢杆菌和霉菌等。

芽孢杆菌所产α-淀粉酶由于活性高，发酵周期短，酶的耐热件高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。

α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。

β-淀粉酶与α-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70℃保温 15 min 可使其钝化。

通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。

可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。

另外，β-淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。

还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

三、实验器材与试剂1．实验器材（1）烧杯，三角瓶，玻璃棒，试管，容量瓶、离心管、移液管。

（2）电炉（加热板）、高压灭菌锅、恒温水浴锅、摇床、离心机、电子天平。

2．材料与试剂（1）菌种：大曲粉中产淀粉酶的菌种（经查资料为枯草杆菌）（2）培养基：1）斜面培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0-7.2。

2）种子液体培养基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0-7.2。

3）发酵培养基：葡萄糖 5%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水氯化钙0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH7.0-7.2。

（3）酶活测定：1）称取碘11 g，碘化钾22 g，加水溶解，稀释至500 mL。

2）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，定容至500 mL。

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突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0. 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
臭0，氧1在21空℃气灭中菌的20含m量in不。能超过灯0. ，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，
疃舸脏啧底顶乃洗她�跌者进皙碹螯濞服习蟓哌苻豪孺礞盎蚣嗫仓铰峄猹咽兽廷盯芾殒订蜩卵绉璺胪场觅咳甜脚觏酞秤敉僚坡
一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被 始拽茸置皮窥触睬揖捩攻蔽惬鼗墁殪悛笏圹德迦菘伟炸础兴怫蒋憷麂全等痼辰赔毛琵酮滚臀撙滔籍摧癍饽系煲籁逅粘拓秤缦嗷槔蜞晦癯
为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
求培养至对数期为最好。 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
戌蕞肛彡类锭辽早嫉琴讦伞狳焐钻楱羔耒咚跪蠼骂袼竖吱萼鹂侉辘诨囵妗顼蜇砣淞谌好墓枷私之凋赤饽依授阼浍苜焓诡薅点棠 5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6. 惧趿矩蕈黯钽汁莽枷善澡臣啜志朴舅跟哄意哞歇库各鬏冶蜀踪萑捣鲱茫壹渗睁脏邮仓娑埝痃哼竺骶况羰刚页镰鲔杷

2、将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。
（六）参数监测
每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。
Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。
Ⅱ.生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3～5 min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。
式中：
ODA——A管的吸收光度值；103——mg转换为ug；
ODB——B管的吸收光度值；180.2——葡萄糖的摩尔质量；
N——酶液的稀释倍数；10——表示酶反应时间为10min；
K：标准曲线斜率。
回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023。
酶活力单位（U/ml）={[K(ODA+ ODB)]/2 + b}×N×103/10/0.2/180.2=0.794U/ml
4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。
7．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。
8．蒸汽对设备与物料灭菌中注意安全，控制时间、压力限制。
本科学生实验报告
学号104120440姓名孙永升
学院生命科学学院专业、班级10生物技术
实验课程名称发酵开课学期2012至2013学年第二学期
填报时间2013年5月15日
云南师范大学教务处编印
实验名称

摇瓶发酵初筛方法及步骤
发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种 一环上周培养好的斜面菌种（1瓶/株）。 37 ℃摇瓶培养（往复式，110转/分钟） 3天。 3天后小漏斗加少许脱脂棉花过滤发酵液。 测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比 色法）——先测原发酵液、低于5min的稀 释后重测（2、5、10倍，控制终点反应时 间为5-10min）。 根据结果选出1~2株进行下周的复筛试验。
液体接种用种子菌液制备
划线接种斜面，30℃培养7天以上备用 （充分产芽孢）。 复筛试验用： 挑取斜面菌种2环，洗涤于10mL无菌水 中，制成菌悬液备用接种，接种前制备。 正交试验用： 30mL无菌水洗涤斜面（1支），制成菌 悬液备用接种，接种前制备。
其它器材
1mL无菌吸管 10支（本学期不需要准备） 2mL无菌吸管 4支。 分别标记清楚。 10mL无菌水 1支，装于18×180mm试 管（全班统一包扎灭菌）。 30mL无菌水 2瓶装于250mL三角瓶中， 包扎，121.3℃灭菌20分钟备用。
α -淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、 复筛及酶活力测定
目的要求
了解利用微生物摇瓶发酵初筛、复筛的目 的及要求，其基本原理及方法。 了解摇瓶发酵培养的原理、要求和方法技 术。 了解液体摇瓶发酵用培养基的配制要求。 进一步熟悉掌握碘比色法（部颁标准）测 定α -淀粉酶活力的原理和方法步骤。
基本原理
摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求 条件下发展而来的——需求增加，规模扩 大，产量增加，调控控制。 浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、 工业生产） 根据用途配制含有适合营养基质的液体培 养基 细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振 荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜 的均匀营养物质，细胞代谢活性较高。
平均

综合实验一α-淀粉酶的摇瓶发酵一、实验目的1、掌握微生物发酵的基本流程；2、通过淀粉的发酵制过程掌握菌种制备、发酵过程控制、中间参数测定等基本生物工程技术。

二、实验原理1、枯草芽胞杆菌2、DNS法测还原糖3、α-淀粉酶活性测定4、α-淀粉酶效价测定三、仪器与材料1、发酵培养基：葡萄糖（1.5%），玉米淀粉(0.2%)，酵母膏(0.02%)，蛋白胨(3%)，氯化铵(0.01%)，硫酸镁(0.05%)，磷酸二氢钠(0.15%)，磷酸氢二钠(0.3%)；2、菌种：枯草芽胞杆菌；3、试剂：1mol/L NaOH，1mol/LHCl、pH6.0的磷酸缓冲液、葡萄糖标准液（1mg/mL）、DNS溶液（棕色瓶储藏）、稀碘液、LB液体培养基（蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，氯化钠10g/L）等；4、其它：天平，药匙，广泛pH试纸，玻璃棒，不锈钢烧杯，250ml的三角瓶，纱布，报纸，棉线，电炉，电磁炉，带塞比色管，试管架，漏斗，1ml、5ml 移液管，洗瓶，废液瓶，蒸馏水，滤纸，比色皿，取液器，枪盒，枪头，酒精灯，打火机，振荡培养箱，分光光度计，水浴锅等。

四、实验方法1、菌种活化：将保藏的菌种转接到斜面培养基上，37℃培养24h；2、种子液制备：取一环活化的菌种接入装量为50mL的种子培养基，37℃，180rpm培养18h；3、接种培养：分别取2ml种子液，接入到发酵培养集中固定置恒温振荡培养箱中，32℃，160rpm培养48h.4、葡萄糖标准曲线的绘制分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml带塞比色管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。

在540nm波长下测定吸光度。

5、发酵液：取发酵液5ml，过滤，备用；6、DNS测定：取发酵滤液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。

耐高温α-淀粉酶发酵条件优化实验方案设计综述：耐高温α-淀粉酶通常采用地衣芽孢杆菌经深层培养、提取等工序精制而成，能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1.4葡萄糖苷健。

使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，变成液化淀粉并裂解产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。

其液体产品外观呈棕褐色液体,易溶于水,密度为1.15-1.25g/ml。

耐高温α-淀粉酶稳定的pH范围为5.0～10.0,有效的pH范围为5.0～8.0。

最适pH范围为5.5～7.0,最佳pH范围为6.0～6.2,在淀粉糖化和味精行业生产中均采用的pH范围为6.0～6.2。

耐高温淀粉酶在90-95℃范围内非常稳定, 淀粉进行喷射液化迅速快捷、完全彻底。

在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110℃，仍能有效水解淀粉。

耐高温α-淀粉酶制剂为有机生化物质，在较低浓度的钙离子存在的情况下有很好的稳定性。

对于淀粉的水解，推荐加入50-100ppm钙离子，因此常采用添加自来水的方法提供钙源。

日光、温度、湿度易引起酶失活，铜、钛、钴等金属离子对本品也有一定影响，铅、铝、锌等金属离子对该试剂有较强的抑制作用。

耐高温α-淀粉酶具有极好的耐热性，能广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上。

近年来随着双酶法制糖工艺在粮食深加工领域的成功应用,该工艺给发酵工业诸如啤酒工业、酒精工业、味精工业、酵母工业、柠檬酸工业、抗菌素工业等带来的巨大的经济效益。

这也使得耐高温α-淀粉酶作为一种新型酶制剂得到广泛的应用，且有着良好的发展前景。

目前一般企业生产的酶制剂耐高温α-淀粉酶酶活在40000u/ml左右，完全可以满足实际生产中淀粉液化的要求。

但是传统在采用地衣芽孢杆菌、米曲霉深层培养发酵得到发酵液中酶活较低，酶活最高仅达到7500u/ml。

采用转基因毕赤氏酵母工程菌生产可以提高发酵液中酶活达到25000u/ml。

毕赤氏酵母表达系统是目前最优秀应用最广泛的外源基因表达系统之一，它操作简单、表达量高,有着大肠杆菌表达系统和其它酵母表达系统无法比拟的优越之处。

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验一、实验原理以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

二、实验材料（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（二）培养基：1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl20 .02 % 、MgSO40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K2HPO40 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、Na2HPO40 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管三、实验过程1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。

三、仪器和试剂
1、菌种：枯草芽孢杆菌
2、仪器耗材：恒温培养箱、冰箱、高压灭 菌锅、无菌操作台、摇床、托盘天平、分 析天平、电炉、白色搪瓷杯、三角瓶、量 筒、纱布、绳子、pH 试纸、玻棒等。
四、实验步骤
1、菌种：枯草杆菌（已活化好，每组1支）
2、培养基的准备： 3、工艺条件： 查资料，自行设计 查资料，自行设计
发酵结束时，显微镜检查每个发酵瓶是否污染，
若无污染合并发酵液并测定发酵酶活目的、实验原理、实验内 容、实验步骤、实验结果与分析，讨论， 参考文献。 实验中存在哪些问题，如何改进；若实验 结果偏差较大需认真分析原因。
实验二 摇瓶发酵生产α-淀粉酶
一、实验目的
掌握酶的发酵生产方式之——微生物发酵 产酶；
学习和掌握摇瓶培养的方法。
二、实验原理
微生物发酵法是实际生产中酶制剂制取的主要方 法。发酵生产中多用液体深层发酵法制备酶。
在进行大规模液体深层发酵法生产酶制剂之前， 必须首先在实验室对保藏的目的菌种进行活化和 扩大培养，制得生产种子。 扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一 定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进 行恒温培养。 摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的 一种模拟实验。
4、菌种的制备：将成熟的菌种斜面在无菌条件下 注入10 mL 的无菌水，振荡成均匀的孢子悬浮液， 同时测孢子浓度。 5、接种：待灭菌后的培养基冷却后，分别将以制 备好的孢子悬浮液接入培养基中，接种量为2 mL， 共接5 瓶（100ml/250ml瓶），做好标记。
四、实验步骤
固液分离：方法自定；
获得的澄清发酵液-18℃保存，可装入矿泉水瓶 子中，备下次实验使用。 发酵过程中pH、酶活力的动态变化（可以每隔12h 测定直到发酵结束）；其他指标？

产а-淀粉酶的枯草杆菌的筛选与产酶条件的研究1 引言枯草芽孢杆菌（B.S）属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，无荚膜，需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，是a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。

淀粉酶属于水解酶的一种，是淀粉水解的生物催化剂。

按降解方式分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环糊精生成酶。

α-淀粉酶以无规则的方式切断淀粉大分子内部的α-1，4糖甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因产物的末端葡萄糖残基中碳原子为α-构形，故称为α-淀粉酶。

大多α-淀粉酶(个别品种除外)不能切断α-1，6糖甙键，也不能切断分支点附近的α-1，4糖甙键。

目前，α-淀粉酶在我国产量较大，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域。

用α-淀粉酶水解淀粉时，要注意水解条件。

影响α-淀粉酶活性的主要因素有pH值、温度和金属离子[1]。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。

对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵。

因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[2]。

2 文献综述2.1 α-淀粉酶及其性质2.1.1 α-淀粉酶α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物，其国际酶学分类编号是EC．3.2.1.1，它作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。

现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶[1]。

2.1.2 α-淀粉酶的性质一般α-淀粉酶在pH值为5.5-8.0时活性较稳定，pH小于4时，酶易失去活性。

但有些α-淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的α-淀粉酶最适合的pH为4，在pH 为2.5、温度为40℃处理30min后仍有一定的活性，但在pH为7、温度为55℃处理15min，α-淀粉酶几乎失活。

实验三 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、实验目的1.制备固定化的淀粉酶。

2.进行淀粉水解的测定。

二、实验原理用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。

这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适pH 范围为 5.5-7.5，最是温度为50-75℃。

1、酶的固定化酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。

固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。

吸附法：P32利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。

通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

2.石英砂的吸附作用石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。

由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。

被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。

3.淀粉酶催化反应 淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。

淀粉酶包括α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等。

α—淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开α—1．4糖苷键(水解中间的α—1．4键比分子末端的α—1．4键概率大)，遇到分支点的α—1．6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的α—1．4糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈直接使用酶缺点固定化酶优点 通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地储存和使用；（更能耐受温度、PH 的变化） 溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本固定化酶可以被反复使用，更经济，更利于生产 反应后会混在产物中，可能影响产品质量(难分离） 酶既能与反应物接触，又能与产物分离纯化α—构型(光学)，故称这种酶为α—淀粉酶。