菌落PCR及菌液电泳经验

菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。

是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。

操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。

操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。

现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。

退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
方法细节：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。

在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。

这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。

当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。

想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。

菌液PCR的经验已有578 次阅读 2013-6-19 11:27 |系统分类:科研笔记由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性。

我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定。

结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。

也难怪老板一口回绝，只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命。

后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6，因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P 出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。

建议使用载体上的通用引物。

通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。

最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

具体方法：1、PCR混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH2O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。

电泳检测是否得到目的片断。

如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。

步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项：设计引物很关键。

一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。

如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。

PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。

是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。

操作简单，快捷，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。

菌液PCR的经验由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen 的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2. 菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rp m摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5. 模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6. 退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C 均可以P出目的条带7. 循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

PCR产物电泳时间及结果分析pCR产物的电泳检测时间PCR产物电泳时间及结果分析pCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带pCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④pCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是pCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做pCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对pCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低pCR扩增的特异性，浓度过低则影响pCR扩增产量甚至使pCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行pCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行pCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

菌落PCR鉴定步骤
菌落PCR鉴定(载体上的通用引物)
（一）菌落的挑取及PCR扩增体系的配制
1.将隔天在生化培养箱过夜培养的平板拿出来，准备好已经灭好菌的经过烘箱烘干的8连管，在超净台中，在每个管中加入20-30μl 的SOC培养基，用牙签或者10uL的枪头在每个板中挑出标记好单菌，收拾好超净台。

2.放入200rpm，37度的摇床，摇30-60min。

3.PCR菌落鉴定体系（20ul)
2×Power Tap Master Mix酶
引物(TP-SR\TP-SF)
ddH
2O
（灭菌）
菌液
10
1/1
6
2
ul
ul
ul
总体积20 ul
（注：2×Power T ap PCR Master Mix 酶，品牌Bioteke Gorporation; Lot ＃0020140918 1ml ；Storage:-20℃）（二）菌液PCR
PCR程序
94℃5min
94℃30s
58℃30s
72℃30s
72℃5min
4℃∞
30x
（三）电泳
全部上样跑电泳并记下上样顺序，（120V、260mA、30min）核酸染料染色15-20分钟，凝胶成像仪拍照。

菌液PCR经验总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物4 d i+ b' D9 _4 _. D6 R5 K如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R9 i' {( P3 O& M2 gpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）- ^5 m5 T8 j" a( t( F挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中* f2 B5 a* q( E$ ~4 p37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上, y9 \& F& Y$ a& P/ N, v. R2 r（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）J提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉,我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度r5.模板的量：1-2ul, ~6 U. i5 _0 @1 z K# ]' w未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）7 v6 O# l" ~; G+ G1 E4 ^7 v2 ^# ^2 b8 m9 T' r( V" l J: c6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成,T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7 @4 D# s. P0 j' a+ l2 u7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P 出来' x& I2 H; W! L6 B* W# A& h, Q0 F8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步a5 w7 C% _. S2 W% M7 s再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇3 b% u& Z7 P: Q$ I- Q4 Q1 y# V补充说明如下：7 v/ [$ Z% S$ X' D V8 `% k7 k鉴于很多同仁提到的假阳性的问题8 D- e' X5 S' E3 J我补充说明一下) M3 C" D; g! G( q- b1 y0 n* c4 W$ ]& j* @1 h# |0 M1.我需要做菌液PCR的目的是为了选取基因重组中的阳性克隆+ w* |. }0 Q" H5 x% {1 Z如果只是鉴定已获取的阳性质粒或是扩增,则不存在假阳性一说i) n2.我后面也补充说明了) R9 B' q3 \. _4 L* o通过调整合适的插入片段和载体的比例，基本上可以使得每个长出的菌落均为阳性菌落# n6 a$ R6 s( s$ G, _7 u后一组我后来通过浓度梯度做出来的图片# ?: p( G0 q5 T! M# w0 O* g插入片段和载体的mol比分别为4:1，7:1，10:1' j1 H3 N- D- w5 R8 b3种比率中7：1的是阳性连接比率最高的6 [4 B0 N% }6 _ S! j8 q0 c: f, [4：1的空载体最多所以，我想强调的是：通过调整合适的插入片段和载体的mol比例是可以完全做到长出的菌落全部为阳性菌落的另外，在挑取菌落的时候也是有讲究的,对于阳性菌落和无插入片段的载体菌落大小上是有一定区别的我在文章后来提到的通过选择具有一定特征的菌落以达到很高的阳性率也是可以做到的就是这个意思G" {我想通过这些手段也完全可以使菌液PCR显得多余所以我在文章的开头也说了,这篇文章应该是适合各位新手开始做重组时候的方法+ \3 |/ B9 O* i最后还有一个因素就是大家做重组的步骤上或许也有一些原因1 y- Y4 v) ?2 M+ w' h8 Z/ h, f7 P! T我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase P$ {, n& X T( Q6 t4 T条件：26°C2-4h （我知道最好是16度过夜，只是苦于我们这里的实验室老师不让我们用PCR仪过夜，其他的设备又不能维持稳定的温度，且还和室温有关）转化：取1-2ul转化20ulTop10感受态细胞最后取150ul涂板，37°C过夜! j中间我也冥思苦想，考虑假阳性的源头最后考虑到的唯一的可能就是来自于未能和载体连接上的插入片段+ z7 M( N0 c1 ^我是直接取的连接产物去做转化2 F# s: B2 X1 r- _+ d* V- J（Invitrogen推荐的是将连接产物稀释至少10倍以上之后取2ul转化）: V- l b* S2 o3 d+ _自然这部分未能连接上的片段也被带入到扩增体系中0 A8 R' w7 u8 y) Y7 ~- ]最后这部分微量的插入片段被PCR仪扩增出来。

载体构建技术经验分享一、PCR 过程中的经验教训做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。

这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。

高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。

PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。

我就曾经用普通的酶进行过PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。

二、PCR 产物直接酶切后连接不成功当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。

但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。

因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧三、T-A 克隆应注意的问题T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。

T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。

但要注意，首先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。

其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。

这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。

进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。

我开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加15ul,我没舍得，加了3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。

后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。

菌落PCR实验步骤菌落PCR资料PCR, 菌落, 资料菌落PCR菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。

是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。

操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。

操作方法：1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。

现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。

退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以我的做法是：用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。

在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。

这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。

当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。

想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。

把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。

取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。

其他的和普通pcr一样。

我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。

先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq 酶。

是的，菌落PCR不难。