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殷纪伟，韩贝贝，马莹雪，等．基于ＳＳＲ分子标记的１５４份桃品种遗传多样性分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（１６）：１８－２６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．１６．００３基于ＳＳＲ分子标记的１５４份桃品种遗传多样性分析殷纪伟１，２，韩贝贝１，马莹雪１，武星廷１，徐振江２，姜建福３，陈昌文３，韩瑞玺１（１．农业农村部科技发展中心，北京１００１７６；２．华南农业大学农学院，广东广州５１０６４２；３．中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州４５０００９） 摘要：利用简单重复序列（ＳＳＲ）分子标记对桃种质资源的遗传多样性和群体结构进行分析，构建桃品种的分子数据库，为桃品种的鉴定提供技术依据。
利用１０个ＳＳＲ标记对１５４份桃品种进行指纹采集，通过聚类分析和群体结构分析研究其遗传多样性。
结果表明，１０对ＳＳＲ引物共检测出１４０个等位变异，变异范围为８～２７；共获得３０４个基因型，变化范围为１７～５９；引物多态性信息含量（ＰＩＣ）变化范围为０．５１０９～０．８２４２，申请品种保护和登记的品种遗传多样性较已知品种低。
根据Ｎｅｉ ｓ遗传距离进行非加权组平均法（ＵＰＧＭＡ）聚类分析，供试品种可划分为５个大类，各品种间的遗传距离在０．０２９３～１．００００之间，其中２对品种未区分开。
对供试品种进行群体结构分析，发现可以划分为４个亚群，大部分材料的亲缘关系比较单一。
方差分析结果表明，１０％的遗传变异来自群体间，７２％的遗传变异来自群体内部，群体内的变异大于群体间。
１５４份桃品种的遗传多样性水平适中，群体间的遗传分化程度处于中等水平，同一育种单位的品种遗传距离较近。
研究结果可为不同类型桃育种创新、分子指纹数据库的构建及品种鉴定提供参考依据。
关键词：桃；ＳＳＲ；遗传多样性；群体结构 中图分类号：Ｓ６６２．１０２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）１６－００１８－０８收稿日期：２０２２－１０－１１基金项目：物种品种资源保护项目（编号：ｈ２０２１０４７２）；农产品质量安全标准体系建设（编号：２１３０１０９）。
SSR分析遗传多样性1 SSR简介简单重复序列，也称微卫星（SSR），其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见的是双核苷酸重复，即（CA）n和（TG）n，在植物基因组中（AT）n最多，长度一般在100bp以内。
尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计以对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以获得其长度多态性。
SSR标记的高度多态性主要来源与串联数目的不同。
根据分离片段的大小决定基因型，并计算等位基因发生频率。
2 SSR的分类根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基，但两端的连续重复核心序列重复数大于 3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开，但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。
3 SSR在植物基因组中的分布在植物中，平均23.3kb就有一个SSR；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，前者两个SSR之间的平均间距为21.2kb，后者为64.6kb；绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。
4 SSR标记的应用目前SSR分子标记已成为系谱分析、分类鉴定、亲缘关系分析、体细胞杂种鉴定、遗传图谱构建、基因定位、育种材料早期选择首选的分子标记之一。
SSR技术已在苹果、梨、桃、杏、葡萄、柑橘、称猴桃、板栗、核桃、樱桃、山植、椰子等果树上有了很多的应用。
水稻遗传学研究中的分子标记技术应用水稻是全球最重要的粮食作物之一。
水稻遗传学研究对于提高水稻的产量、品质和抗逆能力具有重要作用。
分子标记技术是水稻遗传学研究中重要的工具。
本文将介绍分子标记技术在水稻遗传学研究中的应用。
一、分子标记技术的基本原理分子标记技术是通过特定的酶切位点、多态性DNA序列或基因座来标记和分离物种的DNA片段。
分子标记技术可以在不同个体之间寻找差异性，从而进行遗传分析。
在水稻遗传学研究中，分子标记可以用于鉴定遗传多样性、连锁分析、QTL（数量性状位点）定位和基因克隆等方面。
二、SSR分子标记在水稻遗传学研究中的应用SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记是指重复长度为1-7个碱基的DNA序列。
SSR标记在水稻遗传学研究中广泛应用，已被用于水稻种质资源的品种鉴定和遗传多样性的分析。
SSR技术可以通过异源杂交的方式选育具有优异性状的水稻新品种。
SSR标记还可以帮助水稻研究者在QTL定位、基因克隆和表达分析等方面取得成功。
三、SNP分子标记在水稻遗传学研究中的应用SNP（Single Nucleotide Polymorphism）分子标记是指DNA序列上仅存在单个核苷酸的变异。
SNP标记在水稻遗传学研究中有广泛应用。
SNP技术可以通过筛选SNP标记，帮助水稻育种者进行基因敲除和区域特异表达的分析。
SNP技术还可用于遗传多态性鉴定、遗传地图构建和基因定位。
四、CRISPR/CAS9基因编辑在水稻研究中的应用CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，可用于在水稻基因组中实现精准编辑。
CRISPR/Cas9技术可以用于水稻育种和遗传学研究，如克隆和分析QTL、研究水稻抗逆性等。
在水稻育种方面，CRISPR/Cas9技术可以用于改善水稻品质、提高产量和抗病抗旱等方面。
五、总结分子标记技术在水稻遗传学研究中扮演了重要角色。
SSR、SNP和CRISPR/CAS9技术都是最新的生物技术工具，可用于水稻育种和遗传学研究。
SSR分子标记在植物遗传育种中的应用摘要: SSR ( Simple Sequence Repeat)是建立在PCR技术上的一种广泛应用的分子标记，具有含量丰富、多态性高、共显性等优点。
简要介绍了SSR标记技术的原理和特点，并总结了该技术在植物遗传多样性、遗传图谱构建、分子标记辅助选择、种质资源保存、利用评价、植物群体遗传分析等方面的应用。
关键词:SSR ( Simple Sequence Repeat) ；分子标记；遗传多样性；遗传图谱；遗传分析在人类及动植物的基因组中，包括内含子、编码区及染色体上的任一区域，均存在着1-6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列（simple sequence repeats），简称SSR，又称微卫星DNA（microsatellite DNA），其长度大多在100bp 以内。
研究表明，在真核生物中大约每隔10-50kb就存在1个微卫星，其主要以2个核苷酸为重复单位，也有一些微卫星重复单位以3个核苷酸，极少数为4个核苷酸或更多，如（GA）n、（AC）n、（GAA）n、（GATA）n等。
人和动物中的微卫星重复单位主要为（TG），植物基因组中（AT）重复较（AC）重复更为普遍。
而且从进化的角度看，物种间重复序列的差异是自然选择和生物对环境适应的结果，生物进化的水平越高，重复序列占DNA总量的比重就越大，如噬菌体基因组中重复序列占10%，细菌位20%，酵母为30%，小麦为83%，在人的基因组中这一指数高达90%。
遗传标记(Genetic markers)是指与目标性状紧密连锁且与该性状共同分离并易于识别的可遗传等位基因变异。
在遗传育种研究中，遗传标记指的是与目标性状紧密连锁,同该性状共分离的可遗传的标识。
遗传标记已经经历了形态标记,细胞学标记,生化标记和分子标记4个阶段。
前3类遗传标记都是对基因的间接表达,并且标记位点少，多态性差，容易受到季节变化、环境因素等的影响,所以已经逐步被分子标记所代替。
模块八 分子标记技术一、SSR 技术 1.实验目的利用现代分子生物学技术揭示DNA 序列的遗传多态性即建立DNA 水平上的遗传标记。
为分子遗传图谱的构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要性状基因定位与图位克隆、转基因生物鉴定、分子标记辅助育种等研究奠定实验技能基础。
通过此实验了解和掌握利用SSR 和AFLP 分子标记检测植物基因组DNA 的遗传多态性的基本原理和实验方法。
2. 实验原理SSR ：根据SSR 两端保守的单拷贝序列设计一对特异引物，通过PCR 技术将其间的核心微卫星DNA 序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。
每个SSR 座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，扩增每个位点的微卫星DNA 序列，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的带型，就可检测到不同个体在某个SSR 座位上的多态性。
3. 实验仪器离心机、移液器（100-1000ul ，10-50ul ）、PCR 仪、垂直板电泳设备。
4. 实验试剂MgCl 2，引物，dNTP ，10ХPCR 缓冲液，DNA 聚合酶，无菌去离子水。
5. 实验方法（1）将200 µL 离心管、模板DNA 、引物、dNTP 、10 × buffer 、无菌去离子水和DNA 聚合酶置于冰上溶解。
（2）依次向无菌的200 µL 离心管中加入如下成份，轻轻混匀，离心去除气泡。
（3）将离心管置于PCR 仪中，按照以下程序进行PCR 反应。
模板DNA 20-60 ng MgCl2 15-40 nmol 引物（各） 2-8 pmol dNTP 1-5 nmol PCR 缓冲液 1Х DNA 聚合酶 1-5 U Total20 µL（4）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：利用聚丙烯酰胺凝胶检测SSR-PCR 结果。
SSR-PCR 扩增产物可能仅仅存在几个碱基的差异，通常采用聚丙烯酰胺凝胶（银染体系）电泳方法检测。
相对于琼脂糖凝胶电泳而言，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够更好的区分微小片断的差异，能够检出的等位基因位点多，多态性信息含量值较高，因此适用于SSR 标记的结果检测。
小麦RIL群体SSR分子标记偏分离的遗传分析本文将探讨小麦RIL（杂交种群体的关系系列）群体中通过SSR分子标记偏分离（MSR）的遗传分析的方法。
为此，我们分别采用了基因多样性指数、群体化学平衡（PC）、连锁对应分析（LCA）和图形聚类（GC）这4种遗传分析方法。
在分析中，我们发现基因多样性指数和群体化学平衡都指示了小麦RIL群体中存在着大量的遗传冗余，从而支持着它们来自同一种基因池。
然后，我们使用LCA和GC方法发现了382条SSR分子标记中具有显著偏分离的156条标记。
最后，使用此数据集进行了更深入的遗传分析，证明了小麦RIL群体的遗传结构拥有复杂的聚集性结构。
因此，本文得出结论，使用SSR分子标记偏分离的方法，我们可以高效地检测小麦RIL群体中存在的差异性，从而揭示它们的复杂的遗传结构，并有助于开发更有效的植物育种技术。
为了更好地发掘小麦RIL群体中的差异，我们将这些156条标记组装到一个48.1 kb的连续DNA段上，并对其进行了分子功能注释。
结果发现，在这个48.1kb DNA段上，共计有127个基因，其中大部分都表达出了某种特定的功能，如激素代谢、核酸代谢、转录调控等。
此外，有一部分基因来自抗性和自然选择。
这些数据表明，小麦RIL群体中存在大量复杂遗传信息，用于支持植物育种和抗病。
此外，本研究还提出了一些有用的建议，以更有效地利用MSR技术进行植物育种。
例如，应深入研究MSR技术发掘小麦RIL群体保留的遗传多样性，以及如何将MSR特定的遗传信息应用于植物育种中，用于改良植物的农业性状。
同时，应该深入研究MSR技术对植物的抗病性和耐逆性如何影响，以及如何有效利用MSR技术改良植物抗病性和耐逆性等方面。
最后，应当依据MSR技术提出新的研究课题，以更好地发掘小麦RIL群体中未知的遗传信息，并有助于更进一步的植物育种技术应用。
总的来说，MSR技术在小麦RIL群体中发掘出了大量的遗传多样性，有助于植物育种改良。
SSR分子标记遗传分析
实验原理：
SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。
由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。
虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；
（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；
（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。
缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高
实验材料：
欧美山杨杂种幼嫩叶片
实验器具、药品：
模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统
SSR引物及退火温度
位点Loci
重复单元
Repeat unit
引物序列(5′-3′)
Primer sequence (5′-3′)
退火温度
T(℃)
PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R)
63℃
PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F)
TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R)
49.4℃
PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F)
A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R)
55.4℃
实验步骤：
1.总DNA的提取
采用CTAB法提取植物总DNA
（1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热；
（2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末；
（3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀；
（4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清；
（6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质；
（7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA；
（8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。
2.总DNA的检测
用琼脂糖凝胶电泳法对所提取到的基因组DNA进行质量检测。
通常用浓度为0.7%(W/V)的琼脂糖凝胶电泳检测植物的基因组DNA,步骤如下:
（1）称取0.14g琼脂糖,加入20ml 1×TAE电泳缓冲液，在微波炉中加热2分钟左右将琼脂糖溶解（以上数据根据制胶板大小及胶厚度而变化）；
（2）将琼脂糖倒入模具,凝胶厚度一般为0.3-0.5cm迅速在模具一端安插好梳子,检查有无气泡,如有气泡,将气泡赶走。
（3）室温下避光水平放置15-20分钟后,琼脂糖溶液完全凝固,小心拔出梳子,将凝胶放置于电泳槽中。
（6）加入电泳缓冲液至电泳槽中,让液面高于胶面1mm,这样凝胶两端的电压几乎与外加电压相等,电泳效率高。
注意：电泳槽中的缓冲液与凝胶配制所用的缓冲液应为同一批配制，若电泳缓冲液与凝胶中的离子强度和PH值不一致将影响核酸的迁移。
（7）在3ul DNA样品中加入1-2ul的上样缓冲液充分混匀，用移液器将DNA样品加入样品孔中。
溴酚蓝，分子量为670，在不同浓度的凝胶中迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳故被普遍用作指示剂。
（8）接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，切记DNA样品向正极泳动。
电压选择为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),经过计算,选择40V电压
（9）根据指示剂的位置，判断是否终止电泳，切断电源后，再取出凝胶。
含染色剂的凝胶可以直接紫外灯下观察结果或拍照记录。
3.PCR扩增
反应总体积20μL包括:引物F 2μL；引物R 2μL；DNA模板2μL；Taq酶0.3μL；dNTP
O 8.9μL。
1.6μL、10×buffer 2μL；Mg2+ 1.2μL；H
2
反应程序: 94℃预变性3min； 94℃变性45s；退火温度52℃ 45s；72℃延伸105s，反应30个循环；72℃延伸10min。
4.PCR产物的电泳分离
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离PCR产物。
（1）胶板的制备：
①把电泳用的玻璃板分别用水洗净，并用去离子水冲一遍，晾干；
②配胶（21ml）；10.08g尿素，2.1ml 10xTBE，4.2ml 30%的丙烯酰胺加水至21ml
（2）灌胶：在配好的凝胶中加入10.5ul 的TEMED，再加入105ul AP 轻轻摇匀，注意不要起气泡。
然后立起胶板，稍微倾斜，将配好的胶沿玻璃的一侧缓慢倒入胶板间的空隙内，倒满胶后，垂直放置胶板，将梳子的平面插入胶面，静置3h 以上，或过夜。
（胶中不要留有气泡）
（3）上样：胶凝后，轻轻拔出梳子，把胶板固定在电泳槽上，在槽中加入1xTBE溶液没过胶面。
在20ul 样品中加入5ul 凝胶加样缓冲液于80-100℃加热变性5min后立即放于冰上，使其保持单链状态。
上样用微量进样器，混匀，每个样品取10ul。
4.电泳：上完样后，立即开始。
当第二道染料（二甲苯箐FF）即将出胶时停止电泳（一般3h）。
5.银染
（1）倒出电泳液，取下胶板，将两块板轻轻撬开。
用拨胶器将胶从胶板上取下来，放入固
定液中。
（2）固定：将胶放入方盘中，倒入固定液，没过胶面。
轻轻晃动15min，将胶板取出，回收固定液；用去离子水浸泡2min，控干，重复两次。
（2）染色；将胶转入染色液，轻轻摇15min；取出后用去离子水浸泡2min，控干；在去离子水中浸泡20s，立即取出，控干水。
（4）显影：将胶放置于300ml 预冷的显影液中，充分摇动，直至其余条带清晰可见；将回收的等体积固定液倒入显色液中，摇3-5min终止显色；用去离子水洗两遍。
（5）将胶用凝胶成像系统白光照相保存或将胶板置于室温晾干。
然后扫描。
