课程名称： 分子育种学 指导老师： 海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型
分工： 奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析
一、实验目的和要求
1、了解SSR 标记的开发策略；
2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理；
3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。
二、实验容和原理 1、实验容
通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA
真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。
微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。
重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略
SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列的SSR ，不包括含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。
建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性；
（4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。
近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。
开发EST-SSR原理基于生物信息学手段的可开发SSR的方法。在数据库中已存在大量的可免费下载EST序列数据并剔除冗余EST序列，再通过SSR搜索软件获得SSR位点信息，然后根据SSR位点两侧的核酸序列信息的统计与分析，利用软件设计相应的SSR 引物，进而开发SSR标记，最后进行PCR扩增及扩增产物电泳检测。
3）不同的SSR标记开发方法比较
传统方法开发SSR：
传统的SSR 分子标记开发方法简单、易掌握。这种方法在许多作物的SSR 标记开发中被广泛应用，现已获得的基因组SSR 标记中，四分之三以上的是利用传统开发方法获得的。但必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，需花费大量人力，财力，而且效率较低，植物中已报道的阳性克隆比率约为2 %～3 % ，成功获得引物的机率则更低。
图1 传统SSR开发方法流程图
通过富集策略开发SSR标记：
为简化技术环节，提高效率，降低开发成本，通过研究建立了多种采取富积策略的SSR 标记开发方法。
基于RAPD 的开发策略：将RAPD 随机引物与SSR连接，作为PCR扩增引物或者将RAPD扩增产物条带用SSR探针进行Southern杂交，可以有效富集重复序列。虽然目前尚不清楚RAPD有利于SSR 富集的机理,但这一发现大大激发了人们探求富集SSR方法的兴趣。
PIMA ( PCR Isolation of Microsatellite Arrays)方法：先用RAPD引物从基因组中获得随机扩增片段，扩增片段经载体克隆后，用特异SSR及载体引物对克隆阵列进行PCR检测筛选含SSR克隆，对阳性克隆测序。
以上两种利用RAPD 富集SSR的报道，避免了基因组文库的构建，有利于节省时间和人力、物力，但基于此方法进行大量SSR 分离的成功报道并不多。
4）PCR引物设计原则
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高；太长则比较浪费，且难以合成。
引物扩增跨度：1kb之是理想的扩增跨度，2kb左右是有效的扩增跨度，而超过3kb 就无法得到有效的扩增. 特定条件下可扩增长至10kb的片段。
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
避免引物部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位
点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
三、主要仪器设备
计算机
四、操作方法与实验步骤
1、EST序列的获取
可从数据库中直接下载，主要的数据库有：
美国国立生物技术信息中心GenBank/NCBI ( National Center for Biotechnology Information )：；目前有72098808条EST序列，其中植物EST序列24158363条，涉及到895个物种。其中单子叶植物：7263423条：玉米-2019114；水稻-1333022；小麦-11116126。
欧洲生物信息研究所European Bioinformatics Institute (EBI)：/index.html ，包含European Nucleotide Archive；
日本DNA数据库DDBJ（DNA Data Bank of Japan）：.ddbj.nig.ac.jp/；
先以从NCBI下载EST序列为例：首先下直接填写植物名称后按search，再在下搜索栏直接填写植物种属名称后按search，出现以下界面时选EST并点击植物名后，按上述方法下载即可。
2、去冗余（EST序列前处理，在本次实验中由于软件收费略去）
采用EST分析软件前处理和剔除冗余EST：直接获取的EST中包含一些低质量片段（<100 bp），少量载体序列及末端存在polyA/T“尾巴”的序列，在开发标记之前应去除这些“噪音”——去冗余。
这些处理可通过一些软件来进行：cross-match（/）或EST-trimmer （.pgrc.ipk-gathersleben.de/misa/download/est-trimmer.pl），去除“尾巴”和屏蔽载体序列。
可用生物信息学软件去冗余：如Cluster W、CD-HIT [/cd-hi/]（若只考虑建立标记而不求统计相关参数，也可搜索后聚类，剔除冗余的SSR）。
3、SSR的搜寻
可利用以下一些软件在线搜索SSR：
（1）RepeatMasker(/cgi-bin/WEBRepeatMasker)
（2）SSRIT(/db/searches/ssrtool)：
①选择搜索参数：最大值；
②粘贴序列（<100Kb）；
③获得结果和统计相关参数。
（3）Sputnik (bri.fr/outils/Pise/spumik.html)
也可利用MISA、DNAman、ssrhunter或ssrfinder等进行本地化搜索SSR，注意制定搜索SSR的标准。
4、设计SSR引物
利用软件设计相应的SSR引物，常用引物设计软件有primerpremier 5.0和oligo 6.0。
