HPLC-HPCE实验 毛细管 液相色谱
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毛细管电色谱应用在哪些方面
毛细管电色谱(capillary electro chromatography,CEC)以内含色谱固定相的毛细管为分离柱,兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理,既可分离带电物质也可分离中性物质。
毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。
因此,毛细管电色谱法可以说是HPLC和HPCE 的有机结合,它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展,而且柱内无压降,使峰扩展只与溶质扩散系数有关,从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效,同时还具备了HPLC 的选择性。
HPLC是用压力驱动流动相。
流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。
流速在管中呈抛物线轮廓,因而造成了色谱峰谱带的展宽,降低了柱效。
而CEC是采用电场推动流动相。
其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的,因而在毛细管中几乎没有流速梯度。
谱带展宽效应相应的就十分小。
这点是CEC与HPLC的本质差别,也是CEC效率高于HPLC的根本。
(上海通微)。
高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是近年来发展起来的一种分离、分析技术,它是凝胶电泳技术的发展,是高效液相色谱分析的补充。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,HPLC分析高效、快速、微量。
电泳迁移不同分子所带电荷性质、多少不同,形状、大小各异。
一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内,受电场作用,样本中各组分按一定速度迁移,从而形成电泳。
电泳迁移速度(v)可用下式表示:v=uE其中E为电场强度(E=V/L,V为电压,L为毛细管总长度)。
u 为电泳淌度。
电渗迁移:电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。
特殊结构的熔合硅毛细管管壁通常在水溶液中带负电荷,在电压作用下溶液整体向负极移动,形成电渗流。
带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。
分离分析类型根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型:①毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE);②毛细管等速电泳(capillary chromatography,CITP);③毛细管胶速电动色谱(miceller electrokinetic capillary chromatography,MECC);④毛细管凝胶电泳(capillary gelelectrophoresis,CGE);⑤毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing ,CIEF)。
毛细管区带电泳(CZE)为HPCE的基本操作模式,一般采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液,实验条件包括缓冲液浓度、pH值、电压、温度、改性剂(乙腈、甲醇等),用于对带电物质(药物、蛋白质、肽类等)分离分析,对于中性物质无法实现分离。
毛细管胶束电动色谱(MECC)为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂,利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异进行分离,拓宽了CZE的应用范围,适合于中性物质的分离,亦可区别手性化合物,可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析。
HPLC-HPCE实验毛细管液相色谱HPLC法测定水溶液中扑热息痛含量一、教学目标:1. 认识HPLC的结构,熟悉HPLC操作2. 了解HPLC进行分离、定性、定量的方法。
二、教学内容:1.高效液相色谱(HPLC)仪器简介色谱分离的基本原理:组分在固定相与流动相中的分配系数不同。
根据流动相不同,可以分为气相、液相色谱。
液相色谱最为常见。
有机合成实验中常使用常规尺寸的硅胶柱:分离量大、分离度低、分离速度慢、只能对部分物质做半定量。
提高分离效率、稳定性和定性、定量能力的办法:减小颗粒尺寸和粒径分布,增加管长度、均匀地填充固定相。
但这些措施往往增加柱传质阻力。
因此发展出使用微米级颗粒为固定相材料、泵驱动液体流动进行分离的方法即高效液相色谱法。
加上归一法标准曲线内标法原理见仪器分析书书上原理三、仪器组成:以我实验室分离二茂铁(Fc)标记的DNA溶液为例(上图右)。
HPLC系统一般应包括:流动相、泵、进样阀、分离柱、检测器直至废液瓶等部分。
预设提问,在实验中一起讨论,点名回答,计分。
1:从HPLC最基本的原理讲,分离过程中流动相组成逐渐变化能够改变什么?告诉我们为什么梯度洗脱往往比等度洗脱效率高?(提示:从色谱基本原理出发)2:HPLC中的泵应该具有什么样的性质才算是一台好的泵?3:流动相中进入颗粒状杂质会引起什么故障?怎样避免引入颗粒?4:微量进样器的使用还记得吗?如何驱除其中的气泡?5:什么是正向柱和反向柱?6:如果一个气泡进入色谱柱,对仪器是“致命”的损害吗?7:回忆HPLC检测器都可以是哪些?有什么特点?四、实验步骤1)分别移取0.1 0.15 0.2 0.25 mL扑热息痛stock溶液(1mg/mL)至50mL容量瓶,用二次水定容。
配制成4 6 8 10 ug/mL的扑热息痛标准溶液。
注意溶液应倒在干净的烧杯中然后用移液管量取,烧杯和移液管在使用前都应用储备液荡洗。
其他操作遵循“化学分析”实验要求。
毛细管电泳的基本原理及应用摘要:毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,比HPLC 分析高效、快速、微量。
关键词:毛细管电泳原理分离模式应用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE,是一类以毛细管为分离通道,以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。
CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis,CZE)。
但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。
现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出,他们使用了75mm的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分离。
1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳,开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年,Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又发展了电色谱,扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳和高效液相色谱(HPLC)一样,同是液相分离技术,因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充,但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说,毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳(C E)除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外,其仪器结构也比高效液相色谱(HPLC)简单。
C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。
毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点,因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。
毛细管电泳法测定阿司匹林中的水杨酸一、实验目的1 进一步理解毛细管电泳的基本原理;2 熟悉毛细管电泳仪器的构成;3 了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。
二、实验原理:毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。
通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管,对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。
现在,HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析,药物分析,临床分析,无机离子分析,有机分子分析,糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。
人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。
1.仪器结构毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。
其中之一是仪器结构简单(见图1)。
它包括一个高电压源,一根毛细管,紫外检测器及计算机处理数据装置。
另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。
high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode2.分离原理毛细管中的带电粒子在电场的作用下,一方面发生定向移动的电泳迁移,另一方面,由于电泳过程伴随电渗现象,粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。
粒子的实际流速 V 是泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。
即:V = V ep + Veo (1)电渗是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。
CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。
当它和溶液接触时,双电层中产生了过剩的阳离子。
高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流,如图2。
毛细管管壁的带电状态可以进行修饰,管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流,管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。