华南师范大学实验报告
课程名称仪器分析实验实验项目液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯
实验类型□验证□设计□综合实验时间2010 年 3 月31 日
实验指导老师实验评分
一、实验目的
1.掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；
2.了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。
二、实验原理
高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内。
由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，记录成数据。
液相色谱的定性依据是保留时间的相对性，通常相对误差不能大于5%。
定量参数常常采用峰高、峰面积、相对峰高、相对峰面积等。
定量方法通常采用外标法、内标法和面积归一化法。
外标法为标准物质标准溶液制定标准曲线法；内标法为在标准溶液、样品溶液中加入内标物质，以相对峰高、相对面积对标准物质的浓度制定标准曲线；面积归一化法假定所有出峰物质的吸光系数相同，计算某物质的峰面积占所有峰面积的百分比。
三、仪器与试剂：
1.仪器：SCL-10A vp紫外可见双波长检测器；SPD-M10A vp柱温箱；LC-10AT高效液相
色谱仪；10μL微量注射器
2.试剂：2μL/mL苯标液；2μL/mL甲苯标液；0.2μL/mL、2μL/mL、4μL/mL、10μL/mL
的苯与甲苯的混合标准溶液；甲醇溶液；待测试样溶液
四、实验内容与步骤：
1.选择合适的流动相配比，优化色谱条件
设置有关参数：控制流速为1mL/min。
柱温30℃，检测波长354nm。
设置流动相配比（甲醇：水=1：1），用10μL微量注射器注射5μL的10μL/mL苯与甲苯的混合标准溶液进行测定，观察其分离度和出峰时间。
然后改变流动相配比，改进分离，调整出峰时间。
从而得到最佳测定条件。
2.苯、甲苯定性分析：
在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，分别注射5μL2μL/mL苯的标准溶液和2μL/mL甲苯的标准溶液。
观察记录保留时间，确定苯和甲苯的峰。
3.苯、甲苯定量分析：
在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，分别注射5μL 0.2μL/mL、2μL/mL、4μL/mL、10μL/mL苯与甲苯的混合标准溶液，再分别测定苯和甲苯的峰面积，以峰面积对浓度作图，做出工作曲线。
在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，注射5μL的试样，观察记录保留时间和峰面积。
根据峰面积在工作曲线上查处苯和甲苯待侧溶液的浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。
五、数据记录及结果分析：
1. 优化色谱条件
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
min
0.01.0
2.0
3.0
4.0
5.0μV (x10,000)
色谱
由上图可得，在流动相中，甲醇低于75%时，出峰时间过长；甲醇占95%时，虽然出峰时间短，但是两峰的分离度不好。
经过多次调整，最终确定在流动相中，甲醇占85%时，分离度好，出峰时间合适，因此，确定了最佳的流动相配比是，甲醇 ：水=85% ：15%。
2. 定性分析结果：
m
in
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
(x100,000)
从上结果可得，苯的保留时间比甲苯的短。
即是测定混合溶液时，前峰为苯的峰，后峰为甲苯的峰。
75%
85% 95%
甲苯
苯
3.定量分析结果
（1）标准曲线的绘制：
苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：0.2 ul/ml, 2 ul/ml, 4 ul/ml, 10 ul/ml。
（2）未知样品浓度
六、总结讨论
1.本次实验用的色谱柱的填充物是表面键合了碳十八的二氧化硅，甲苯和碳十八之间的亲和力比较强，另外，苯和甲苯的极性相差不大，但苯的分子量较小，较容易流出，因此苯先出峰。
2.实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单。
只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。
而采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。
3.本次实验绘制得的标准曲线的相关系数非常接近1，但是比较苯和甲苯两条标准曲线
的相关系数，甲苯的标准曲线的相关系数较低，可能是由于甲苯的稳定性比苯的差，甲苯在实验过程中，少量被氧化。
另外，所得的紫外谱图中，除了溶剂峰和被测物质的峰外，还有一些杂质峰，这些可能是甲苯氧化的产物。
4.高效液相色谱系统中气泡对检测的影响
在进行液相色谱分析时，如果流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，使系统的流路中存在气泡。
由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降，甚至掩盖信号峰；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。
造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。
为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。
