蛋白酶活性测定方法

蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定1、试剂配制①1%的酪素溶液：用 pH7.4 的 0.2M 磷酸盐缓冲溶液配制。

PH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M 磷酸氢二钠（27.8g NaHPO4·2H2O溶于 1L 蒸馏水中）19ml 加 0.2M 磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）81ml 即成。

②0.1N 硫酸。

③20%硫酸钠。

④2%茚三酮液：2g 茚三酮溶于 100ml 丙酮。

⑤甲苯。

⑥甘氨酸标准溶液：取 0.1g 甘氨酸溶液水中，定容 1L，则得 1ml 含 0.02mg 氨基氮的标准液。

再稀释 10 倍做成标准液。

标准曲线的绘制：分别吸取工作液 1,3,5,7,9,13ml 移于50ml 容量瓶中，加 1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。

在风光光度计上于 500nm 处比色测定颜色深度。

以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。

2、操作步骤称 4g 风干土，置于 50ml 三角瓶中，加 20ml1%酪素溶液和 1ml 甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养 24h。

培养结束后，于混合物中加 2ml0.1N 硫酸和 12ml 20% 硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心 15min(6000 转/min)。

取上清液2ml，置于 50ml 容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。

为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

蛋白酶活性，以 24 小时后1g 土壤中氨基氮的毫克数表示。

3、结果计算NH2-N(mg)=a×5式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数5——换算成 1g 土的系数。

蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。

测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。

2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。

荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。

3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。

通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。

4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。

5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。

需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。

蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。

在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。

一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。

二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。

底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。

三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。

淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖昔酶的活性要求、测定方法及判定标准1.酶活性测定 1.1活性侧定淀粉为底物，以Nelson/Somogyi还原糖测试淀粉酶活性（U/mL);10000＋1000(1个酶活力单位定义为：40℃,pH6.5时，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量）。

以对硝基苯基麦芽糖为底物测试淀粉酶活性（Ceralpha)（U/mL):3000+300（1个酶活力单位定义为：40℃,pH6.5时，每分钟释放1μmol对硝基苯基所需要的酶量）。

1.2活性测定酪蛋白测试蛋白酶活性：300一400U/mL[1个酶活力单位定义为：40℃,pH8.0时，每分钟从可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯乙酸）1μmol酪氨酸所需要的酶量]；或7一15U/mg[1个酶活力单位定义为：37℃,pH7.5时，每分钟从酪蛋白中水解得到一定量的酪氨酸（相当于1.0pmol酪氨酸在显色反应中所引起的色彩变幻，显色用Folin一Ciocalteau试剂）时所需要的酶量]。

偶氮一酪蛋白测试蛋白酶活性（U/mL);300一400[l内肽酶活力单位定义为：40℃,pH8.0时，每分钟从可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯乙酸）1μmol酪氨酸所需要的酶量]。

1.3淀粉葡萄糖苷酶活性侧定淀粉／葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法测试淀粉葡萄糖苷酶活性（U/mL);2000一3300[l个酶活力单位定义为：40℃,pH4.5时，每分钟释放1μmol葡萄糖所需要的酶量]。

对一硝基苯基一麦芽糖苷(PNPBM）法测试淀粉葡萄糖昔酶活性（U/mL)：130一200[l个酶活力单位定义（1PNP单位）为：40℃时，有过量的1β-葡萄糖苷酶存在下，每分钟从对一硝基苯基-β一麦芽糖苷释放1μmol对一硝基苯基所需要的酶量]。

2.干扰酶市售热稳定a一淀粉酶、蛋白酶普通不易受到其他酶的干扰，蛋白酶制备时可能会混入极低含量的β一葡聚糖酶，但不会影响总膳食纤维测定。

1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。

此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
称取29过lm二筛的风干土样置于IOOml三角瓶中。

往三角瓶中加入0.5ml甲苯，摇匀后放置15分钟。

再加入10ml用pH7.4磷酸缓冲液配制的白明胶溶液，将瓶塞紧，小心摇荡。

将三角瓶置于30℃恒温箱中，培养24h。

培养结束后，将瓶中悬液用致密滤纸过滤至另一三角瓶中。

吸取sml滤液于一试管中，加 0.5ml0.IN硫酸和 3ml20%硫酸钠以沉淀蛋白质，然后再过滤到另一试管中。

于上述试管中加入lm120/0荀三酮溶液，将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴上
加热 10min。

将着色液转移到50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度。

用光电比色计于56Onm处进行比色测定。

实验设无土对照和无基质对照。

蛋白酶活性以24h后19土壤中酶促反应后生成的甘氨酸毫克数表示。

中性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定
取10.00g新鲜土壤(<lmm)于 100ml容量瓶中，加入1.5ml甲苯，室温下静置15min，然后加 10ml磷酸苯二钠溶液和ZOml柠檬酸缓冲溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37’C下培养3h，用38.C去离子水定容至IOOml，摇匀后迅速过滤。

同时做空白对照，用10ml去离子水代替磷酸苯二钠溶液。

三次重复。

取上述滤液卜4ml于 50ml容量瓶中，加 2.5ml缓冲液，混匀后用去离子水稀释至大约4Oml，再加0.5m12，6一二滇2424酮氯亚按溶液，室温下20一3Omin，定容至50ml，在 600nm处比色测定。

结果以24h后19土壤中释放出的酚的mg数表示。

蛋白酶体的检测方法
蛋白酶体是细胞内的重要器官，它在细胞内起着分解和降解蛋
白质的作用。

检测蛋白酶体的活性对于研究细胞的生物学功能和疾
病的发生具有重要意义。

目前，有多种方法可以用于检测蛋白酶体
的活性，以下是其中一些常用的方法：
1. 荧光显微镜观察，荧光显微镜可以观察蛋白酶体的形态和分布，结合荧光标记的蛋白质底物，可以直接观察蛋白酶体的活性和
分解过程。

2. 蛋白酶体活性检测试剂盒，商业化的蛋白酶体活性检测试剂
盒可以通过荧光或发光信号来检测蛋白酶体的活性，这些试剂盒通
常包含底物和检测试剂，操作简便，适用于高通量筛选和实验室研究。

3. 蛋白酶体特异性抑制剂，通过使用特异性的蛋白酶体抑制剂，可以抑制蛋白酶体的活性，从而间接检测蛋白酶体的功能。

4. 免疫印迹分析，利用特异性抗体对蛋白酶体相关蛋白进行免
疫印迹分析，可以检测蛋白酶体的相关蛋白表达水平，间接反映蛋
白酶体的活性。

总的来说，蛋白酶体的检测方法多种多样，可以根据实验需要选择合适的方法进行检测。

这些方法的应用可以帮助研究人员更好地理解蛋白酶体在细胞内的功能和调控机制，为相关疾病的研究和治疗提供重要的参考。