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氨基酸⽣产第⼀章氨基酸的概述⼀、氨基酸的物理性质氨基酸系⽆⾊或⽩⾊晶体，具有200℃以上的⾼熔点，熔融的同时也分解。
除了脯氨酸和羟脯氨酸溶于酒精外，⼀般都不溶于有机溶剂，⽽易溶于⽔，在⽔中的溶解度随氨基酸的种类⽽异，在酸性或碱性中溶解度增⼤。
1、氨基酸的酸碱度α-氨基酸中存在α-氨基和α-是他们在结构。
按其酸碱性质的不同，可将其分为三⼤类。
即酸性氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸。
其中以种性氨基酸的种类最多。
2、两性电解质特性氨基酸分⼦内含有氨基和羧基，汽⽔溶液随PH值不同⽽离解，但是，侧链上的氨基，羧基，咪唑基，酚基等的存在，PK,PI受到影响、氨基酸直接⽤离⼦交换树脂和离⼦交换膜分离，间接⽤溶度差晶析分离都是利⽤氨基酸阴阳离⼦的两性电解质性质。
⼆、氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质与其分⼦的特殊官能团如羧基、氨基和⽀链R集团是分不开的氨基酸的羧基具有-羧酸羧基的性质，氨基酸的氨基具有伯胺氨基的性质，NH基与COOH2基共同参加的离⼦交换反应，与⾦属离⼦形成配合物等。
三、氨基酸的⽤途氨基酸是构成蛋⽩质的基本单位，是合成⼈体激素、酶及抗体的原料，参与⼈体新陈代谢和各种⽣理活动，再⽣命中显⽰特殊作⽤。
因此各种不同的氨基酸可以⽤来治疗不同的疾病。
不但氨基酸本⾝有治疗作⽤，氨基酸的衍⽣物也有治疗作⽤。
20多年来，氨基酸在医药、保健⽅⾯的应⽤进展迅速，作为营养剂代谢改善剂、抗溃疡、防辐射、抗菌、治癌、镇痛，以及为特殊病⼈配制⼈⼯合成膳⾷等应⽤越来越多，议案计算为原料的激素，抗菌素，酶抑制剂，抗癌药等⽣物活性多肽，层出不穷。
氨基酸是组成蛋⽩质的基本单位，也是蛋⽩质在体内代谢的基本形式，各种氨基酸的代谢异常往往产⽣蛋⽩质代谢紊乱，可以⽤某些氨基酸治疗这些疾病。
此外，由于胃肠消化系统功能障碍，烧伤、外伤、⼿术等⼤出⾎造成的蛋⽩质缺损或低蛋⽩证，⽤氨基酸复合制剂治疗，具有良好的效果；对⼀些特殊环境下的⼯作⼈员的特殊营养亦需⽤专门的氨基酸制剂。
２００６年第４ｌ卷第３期生物学通报１９植物次生物的代谢途径季志平苏印泉张存莉（西北农林科技大学林学院陕西杨陵７１２１００）摘要系统地介绍了关于植物次生物代谢途径方面的研究成果．归纳了植物次生物的３个主要代射途径：酚类代谢途径、萜类代谢途径、生物碱代谢途径，并对其代谢机理进行了探讨。
关键词次生代谢物代谢途径机理植物次生代谢产物是植物体利用某些初生代谢产物，在一系列酶的催化作用下，形成的一些特殊化学物质。
这些化学物质是细胞生命活动或植物正常生长发育非必需的小分子有机化合物．其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。
次生代谢产物是植物对环境适应的结果。
次生代谢物为人类提供了丰富的药物、香料和工业原料．对人类的生产和生活具有重要的作用。
植物次生代谢物种类繁多，结构迥异，一般分为酚类、萜类、含氮有机物三大类，每一类已知化合物都有数千种甚至数万种以上，如黄酮类、酚类、香豆素、木脂素、生物碱、萜类、甾类、皂苷和多炔类等。
这些次生代谢产物在植物体内主要通过苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径、生物碱合成途径形成。
莽草酸途径主要能提供合成一些次生代谢物的前体。
１酚类合成途径酚类主要包括黄酮类、简单酚类和醌类等。
黄酮类化合物系色原烷（ｃｈｒｏｍａｎｅ）或色原酮（ｃｈｍｍａｎｅ）的２一或３一苯基衍生物，泛指由两个芳香环（Ａ和Ｂ）通过中央三碳链相互连接而成一系列化合物．可以分为１４种主要类型．酚类化合物主要是通过苯丙基类生物合成途径合成的（图１）。
植物次生代谢物的合成途径通常是以不同类别的次生代谢物合成途径为单位即代谢频道（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｈａｎｎｅｌ）的形成存在。
不同代谢频道分布在植物不同的器官、组织、细胞或细胞内不同的细胞器即分隔（ｃｏｍ．ｐａｒｔｒｎｅｎｔ）内，不同代谢频道ＱＴＬ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ）可能分布在不同的染色体上．次生代谢物生物合成“代谢频道”的存在，有效地隔绝了次生代谢物合成过程中间产物在细胞内扩散，有利于底物与酶的有效结合和酶促反应的顺利进行，减少次生代谢途径中不同支路之间争夺底物的现象及有毒中间产物对细胞的伤害，并使细胞内多种类型次生代谢物的合成途径得以同时存在。
微生物学报Act a Microbiologic a Sinica54( 7) : 721 －727; 4 July 2014ISSN 0001 －6209; CN 11 －1995 / Qhttp: / / j o urnals〃 im〃 a c〃 cn / actamicr o cn d o i:10. 13343 / j〃 cnki〃w s x b〃 2014. 07. 001调控乳酸菌酸胁迫抗性研究进展吴重德，黄钧，周荣清*四川大学轻纺与食品学院，皮革化学与工程教育部重点实验室，四川成都610065摘要: 作为工业化的细胞工厂，乳酸菌广泛应用于食品、农业和医药等行业。
酸胁迫是乳酸菌在发酵生产以及作为益生菌在人体胃肠道系统中广泛存在的一种环境胁迫，严重影响乳酸菌的生理功能。
近年来，随着系统生物学和代谢工程等技术的发展，为进一步揭示乳酸菌酸胁迫抗性机制并提高其耐酸性能带来了可能。
本文综述了乳酸菌酸胁迫研究进展，介绍了乳酸菌应对酸胁迫的生理机制，并提出了提升乳酸菌酸胁迫抗性的策略。
关键词: 乳酸菌，酸胁迫，氨基酸代谢，细胞膜，交互保护中图分类号: Q935文章编号: 0001-6209( 2014) 07-0721-07乳酸菌是一类可发酵糖类并产生以乳酸为主要代谢产物的革兰氏阳性菌的总称，广泛应用于食品、医药、饲料等工业［1］。
然而在乳酸菌的发酵生产、工业应用以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都会面临多种环境胁迫，包括酸、盐、冷冻胁迫等，这些环境胁迫严重影响了乳酸菌正常的生理代谢，从而影响了食品微生物制造的效率和益生功能的发挥。
因此，如何提高乳酸菌对环境胁迫的抗性已成为学术界和产业界共同关注的焦点问题。
酸胁迫是乳酸菌面临的最为严重的挑战之一，应对酸胁迫，乳酸菌往往会诱发多种胁迫响应机制，包括调控胞内pH 的动态平衡、诱导表达胁迫应激蛋白以及保持细胞膜生理功能等［2 －3］。
近年来，随着代谢工程和系统生物学等新技术和新手段的不断出现，使得从全局水平上系统解析乳酸菌酸胁迫应激反应以及酸胁迫抗性机制成为可能，从而为定向改造乳酸菌生理功能，构建酸胁迫抗性菌株奠定了基础。
N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的化学修饰1翁秋萍，陆高圣，李环*，韦萍南京工业大学制药与生命科学学院，南京（210009）E-mail：wqp8731650@摘要：采用PMSF、NBS、DTNB、DEPC、WRK五种化学试剂，选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中丝氨酸的羟基、色氨酸的吲哚基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、天冬氨酸和谷氨酸的羧基，研究氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。
结果显示，以DEPC、WRK 修饰后，酶的活力明显下降，而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大，说明组氨酸和酸性氨基酸可能为酶活性中心的必需氨基酸，而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的形成。
底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用，保护作用随浓度增加而增加。
关键词：N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶，活性中心，化学修饰，底物保护中图分类号：Q556 文献标识码：Ａ大肠杆菌中argE编码的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithine deacetylase,简称NAOase；EC3.5.1.16）催化N-乙酰鸟氨酸脱去乙酰基，生成L-鸟氨酸。
该反应是精氨酸合成关键的一步[1-2]。
NAOase可应用于氨基酸立体拆分[2]、农林除草[7]方面，同时也具有潜在的医药应用价值[1,5,7]。
因此对N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的研究具有重要的理论研究意义及生产价值。
目前国内外对该酶的研究较少，国外对此酶的作用机理、底物特异性、基因序列、对金属离子对其影响等方面方面有了一定的研究[1-6]，国内主要研究了该酶的高效表达、纯化和复性，及其发酵培养基的优化等方面[7～9]，而对该酶的具体催化机制、酶的构象、活性中心组成、底物和酶的结合位点、三维结构等基础性研究尚未见报道[3-6]。
蛋白质的化学修饰是研究酶的活性中心和探清酶必需基团组成的一个有效方法，也是研究蛋白质结构与功能的重要手段，对于空间结构未知的蛋白质分子尤为重要。
李东霞 等/生物法合成戊二胺研究进展Chinese Journal of Biotechnology/cjbcn February 25, 2014, 30(2): 161−174 DOI: 10.13345/j.cjb.130256 ©2014 Chin J Biotech, All rights reservedReceived : May 18, 2013; Accepted : August 20, 2013Supported by : National Natural Science Foundation of China (No. 21176190), Key Technology Research and Development Program of Tianjin, China (No. 11ZCKFSY00900), Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (No. 11JCYBJC09600), Changjiang Scholars and Innovative Research Team (No. IRT1166).Corresponding author : Ming Li. Tel: +86-22-60601958; Fax: +86-22-60602298; E-mail: liming09@国家自然科学基金(No. 21176910), 天津市科技支撑计划 (No. 11ZCKFSY00900), 天津市应用基础及前沿技术研究计划(No. 11JCYBJC 09600), 长江学者与创新团队项目(No. IRT1166) 资助。
生物工程学报生物法合成戊二胺研究进展李东霞，黎明，王洪鑫，王舒雅，路福平天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 国家工业酶工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457李东霞, 黎明, 王洪鑫, 等. 生物法合成戊二胺研究进展. 生物工程学报, 2014, 30(2): 161−174.Li DX, Li M, Wang HX, et al. Progress in biosythesis of diaminopentane. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 161−174.摘 要: 随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。
第38卷第2期 2008年4月工业微生物Industrial M icrobiologyVol.38No.2 Apr.2008基金项目:国家973项目基金资助(编号2003CB7160004)作者简介:陈悦(1982~),女,江苏南京人,在读硕士,研究方向:酶工程。
E -mail:en dospore@产乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌的构建及遗传稳定性研究陈 悦, 李 环, 韦 萍(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京210009)摘 要 利用质粒pET 22b(+)为表达载体,成功构建了产N 乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌BL21 pET22b(+) argE ,并考察了重组质粒的稳定性。
双酶切鉴定了质粒构建正确,SDS PAGE 电泳证实了该菌可高效表达目的蛋白。
连续传代50次实验表明重组质粒具有结构稳定性。
无选择压力连续传代时,质粒丢失严重;有选择压力时连续传代未发生质粒丢失现象,具有较好的分离稳定性。
发酵过程中,用羧苄青霉素代替氨苄青霉素,质粒稳定率由77.78%提高到86.42%。
羧苄青霉素浓度为200 g mL 时,质粒稳定率提高到98.33%。
关键词:乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶; 基因工程菌; 重组质粒; 遗传稳定性 在大肠杆菌内,由谷氨酸合成精氨酸的代谢途径包括8步酶催化反应,编码这八种酶的基因分别以argA H 表示,其中ar gE 编码的N 乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(EC3.5.1.16)催化N 乙酰鸟氨酸脱去乙酰基而形成鸟氨酸[1]。
1992年,Thierry Meinnel首次从大肠杆菌中分离得到argE 基因[2]。
随后,国外又研究了该酶的酶学性质、作用机理、底物特异性及金属离子的影响[1~3],而对该酶的具体催化机制、酶的构象、活性中心的研究甚少,国内还未见报道,所以对该酶的研究具有重要的理论意义。
近年来,手性氨基酸的拆分逐渐受到重视。
国内外主要是从米曲霉、猪肾等生物材料中提取氨基酰化酶并将其固定化后用于工业酶法拆分手性氨基酸,但该法存在发酵周期长,酶活力低,生产成本高等问题,并且未见产氨基酰化酶基因工程菌用于产业化的报道。
乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶只选择性作用于L 型甲酰或乙酰化的氨基酸,脱去酰基生成L 氨基酸,同样可以达到手性拆分D,L 型消旋氨基酸的目的。
且该酶具有广泛的底物特异性,故构建产此酶的工程菌应用于氨基酸的手性拆分具有高表达量、发酵周期短、酶活力高、生产成本低等优点,有较大的工业应用前景。
除此之外,该酶还可以应用于抗生素领域[3]及林牧业领域[4]。
因此,对于该酶及其工程菌的研究还具有实际的工业应用价值。
本实验室应用pET 表达系统,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,成功地构建了能高效表达argE 基因的工程菌株,解决了野生菌株产酶活力低,不适于工业化生产的问题。
工程菌的表达量很大,但同时也带来了重组质粒在宿主菌中的遗传稳定性问题。
依据重组质粒的变化本质,质粒不稳定性分为结构不稳定性和分离不稳定性。
前者主要由于DNA 的插入、缺失或重排,使需要的基因功能丧失;后者出现在细胞分裂过程中,由于质粒在子代细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒[5]。
本文就这两方面对重组工程菌BL21 pET22b(+) argE 的质粒稳定性进行了研究,为今后大规模生产奠定基础。
1 材料和方法1.1 质粒与宿主菌表达载体pET22b(+)(购自Novagen 公司),宿主菌E .coli BL21(DE3)由本实验室保存。
1.2 试剂蛋白胨,酵母粉(Oxoid,UK);IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,进口分装)。
其余均为国产分析纯试剂。
拆分底物N 乙酰D,L 蛋氨酸为四川同晟氨基酸有限公司产品,纯度>98%。
重结晶后以1.0%的茚三酮乙醇溶液作显色检验,证实无残余D,L 蛋氨酸后作为拆分底物。
使用时以0.05mol L pH7.0的磷酸缓冲液配成0.06mol L的底物,并加入终浓度为0.1m mol L的CoCl2溶液,调pH7.0。
1.3 重组质粒的构建根据目的基因argE和表达载体的基因序列,设计两条引物,由申能博彩合成。
上游引物为5 CAT GCCAT GGAAAACAAATTACCGCC 3 ,下游引物为5 CCGCTCGAGATGCCAGCAAAAATG 3 ,分别引入Nco 和X ho 酶切位点。
DNA酶切、连接、转化和细菌感受态制备等基本基因操作技术参照文献[6]及有关公司的操作手册。
1.4 工程菌的诱导表达及SDS PAGE新鲜活化菌种接种于LB培养基(氨苄青霉素50 g mL),37 ,180r min培养3h,加入1.0mmol L IPTG,30 ,150r m in诱导16h,收集菌体,10% SDS PAGE检测表达产物。
1.5 培养基及培养条件1.5.1 发酵培养基(g L)蛋白胨16.0,甘油10.0,硫酸铵8.0,NaCl5.0, M gSO40.5,M nSO40.025,NiSO40.1,ZnSO40.005, CuSO40.01,硼酸0.03,NaMoO40.05,50 g mL羧苄青霉素,pH7.0。
1.5.2 菌种培养条件新鲜活化菌种接种于发酵培养基,装液量为50mL 500m L。
37 ,180r min振荡培养3h后,加入10g L乳糖作为诱导剂,30 诱导16h。
1.6 酶活测定方法茚三酮显色法[7]。
由于酶分子、菌体本身中所含氮及试剂中微量氮皆会干扰茚三酮显色,故每个样品均做空白实验。
以零转化时间的样品同样操作作为空白。
酶活单位定义为在37 和pH7.0条件下,催化生成1 mol的L Met所需要的酶量。
酶的比酶活定义为每mL发酵液每小时催化生成L Met的 mol数。
1.7 基因工程菌遗传稳定性研究1.7.1 连续传代将鉴定后的基因工程菌进行适当稀释,涂布在LB(+)平板上(含100 g m L羧苄青霉素),于37 恒温箱中温育24h。
随机挑取50个单菌落,同一菌落分别接种在LB(+)和LB( )(无羧苄青霉素)上,于37 恒温箱中温育24h(称为第1代)。
将LB( )上的菌落接种于LB( )上,将LB(+)上的菌落接种于LB(+)上,37 再培养24h(称为第2代)。
依次进行连续传代50次,对两种平板上生长的菌落分别进行计数。
1.7.2 平板传代稳定性鉴定在传代过程中,每隔一定天数将LB( )上的菌落接种于LB(+)上,菌落计数,计算该重组质粒在无选择压力下的遗传稳定率。
经连续传代培养后,对在LB( )和LB(+)培养基上生长的菌诱导表达,并抽提质粒、作双酶切图谱分析及SDS PAGE,从而检测该工程菌质粒的结构稳定性。
1.7.3 发酵条件下稳定性鉴定发酵液稀释106倍,分别涂布于LB(+)和LB ( )平板上,37 恒温箱中温育24h,以两种平板菌落数上的比值(LB(+) LB( ))间接表示该条件下质粒的质粒稳定率。
2 结果2.1 表达质粒pE T22b(+) argE的构建及酶切鉴定选择表达载体pET 22b(+),构建了在T7启动子控制下的argE基因的大肠杆菌表达质粒,如图1所示。
目的基因的大小为1152bp,pET22b的大小为5493bp,采用N co X ho 双酶切再连接后,新构建的质粒大小为6583bp。
图1 重组质粒pET22b(+) argE的构建第2期 工 业 微 生 物第38卷图2 质粒pET22b(+) argE酶切电泳图谱1 2:pET22b(+) argE Pst +Hin d3:pET22b(+) Pst +Hin d将构建好的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)中,筛选重组菌BL21 pET22b argE。
根据目的基因argE和表达载体的酶切图谱,提取质粒后,选用限制性内切酶Pst 和Hin d 对重组质粒进行双酶切鉴定。
若为阳性克隆,双酶切后,所产生的片段大小应为2140bp和4443bp。
若为阴性克隆,所产生的片段大小为4180bp和1313bp。
酶切鉴定结果见图2。
随机挑选的两个重组质粒经酶切后,在2000bp及4000bp附近均有明显条带,而空质粒在1000bp~1500bp间有明显条带。
结果和理论分析相吻合,说明重组质粒构建正确。
2.2 重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及活性检测将含有表达质粒的单克隆菌落在LB培养基(含氨苄青霉素50mg L)中37 培养3h后,采用终浓度为1.0m mol L的IPTG作为诱导剂,分别在37 和30 下诱导表达16h,离心收集菌体,进行酶活测定及SDS PAGE电泳。
全菌总蛋白质SDS PAGE电泳结果如图3所示。
与未诱导的菌对照,在43,000Da左右有一明显的表达条带,且分子量与理论值42,350Da相符,证明了该条带为诱导后产生,目的蛋白为诱导酶,必须有诱导剂才能表达目的蛋白。
37 诱导时目的蛋白表达量较大,但酶活仅为7.69U mL,降低温度至30 诱导,表达量有所下降,但酶活大幅增加,为68.09U mL。
这可能由于表达量太高太快导致目的蛋白来不及正确折叠而形成不可溶的没有活性的包涵体。
综合SDS PAGE及酶活测定,均表明该重组菌的构建正确,可高效表达目的蛋白,具有乙酰鸟氨酸脱酰基酶活力。
图3 表达产物SDS PAGE结果1:not induced;2 3:induced at37 w ith1mmol LIPTG;4:induced at30 w ith1mmol L IPTG;2.3 重组质粒结构稳定性大肠杆菌表达系统由于具有价格低廉,操作简便等优点,是目前最常用的外源蛋白表达系统,其重组蛋白的表达量可达细胞蛋白的50%。
然而,在研究中也发现,外源基因的高水平表达,会增加质粒的不稳定性,从而影响产物的得率[8]。
图4 连续传代后,重组质粒的电泳鉴定1~2:incubated in LB(+)after50generations3:incubated in LB( )after50generations随机挑选转接50次的工程菌抽提质粒,结果如图4所示,所挑菌中均含有质粒。
对所提质粒进行酶切验证,结果如图5所示,Hin d 、Pst 双酶切后,重组子被切下约2000bp与4000bp的DNA片段,与初始菌株结果一致,证明重组质粒pET22b(+) argE 在连续传代50次后仍保持质粒结构正确。
对随机挑选的工程菌诱导表达,离心收集菌体第2期陈 悦,等:产乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌的构建及遗传稳定性研究第38卷图5 连续传代后,重组质粒pET22b(+) argE 的双酶切鉴定1~2:i ncubated in LB(+)after 50generations 3:i ncubated in LB( )after 50generati ons 4:DNA M arker后进行SDS PAGE 电泳验证,结果如图6所示。
