Waters HILIC Atlantis BEH XBridge色谱柱特性与方法建立

亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。

本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。

1.HILIC的概念亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。

它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。

而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

2.HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。

更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。

3.HILIC影响保留的主要因素普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。

影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。

在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水,流动相中水是最强的洗脱溶剂。

一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。

如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。

Figure1.HILICretentionasafunctionofpolarmodifier.100mmlengthACQUITYUPLC BEHHILICcolumn.Peaks:1=methacrylicacid,2=cytosine,3=nortriptyline,4= nicotinicacid.4.HILIC与RP-HPLC的比较传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。

XBridge BEH C 4, 300Å, 3.5, 5和10 µm 蛋白专用色谱柱能为生物大分子提供出色的峰形、极高的效率和良好的回收率，而这类生物大分子对于较小孔径或较长链键合相的色谱柱来说太大或疏水性太强而无法实现分离。

对填料基质和键合相的选择是为了在高pH 和低pH ，以及高温下均能提供出色的稳定性。

XBridge BEH C 4, 300Å蛋白专用填料在通过cGMP 和ISO9002认证的工厂采用超纯试剂制造而成。

每批XBridge BEH C 4反相蛋白专用色谱柱填料均已使用蛋白测试混合物进行鉴定，采用窄范围的技术指标进行质量控制，确保色谱柱的重现性能。

每一根色谱柱的柱效都进行了单独测试，并且每根色谱柱随附有性能测试色谱图以及合格证书。

II. 入门指南 a. 色谱柱安装b. 色谱柱平衡c. 初始柱效测定d. 对新色谱柱进行基准检查的 实用性功能测试III. 色谱柱使用 a. 样品制备b. pH 操作限值c. 溶剂d. 压力e. 温度IV. 缩放分离V. 故障排除VI. 色谱柱清洗、再生和储存a. 清洗与再生b. 储存 VII. 将色谱柱连接到HPLCa. 色谱柱接头和系统管路注意事项b. 测量系统谱带展宽体积 VIII. 测量梯度系统体积(或驻留体积)[ 维护和使用手册 ]II. 入门指南每根XBridge BEH C4蛋白专用色谱柱均具有合格证书和性能测试色谱图。

合格证书为每批填料所特有，包括批号、未键合颗粒和键合颗粒的分析，以及色谱结果和检测条件。

性能测试色谱图为每根色谱柱特有，其中包含以下信息：批号、色谱柱序列号、USP理论塔板数、USP拖尾因子、保留因子和色谱条件。

这些数据应当保存以备将来参考。

a. 色谱柱安装注：下述步骤给出的流速用于4.6 mm内径色谱柱的典型3.5 ìm填料。

请根据将要安装的色谱柱内经，相应地按比例升高或降低流速。

waters xbridge protein beh色谱柱使用说明1. 引言1.1 概述在生物医学研究和制药领域中，蛋白质是至关重要的研究对象。

为了更好地理解蛋白质的结构和功能，科学家们需要利用高效的色谱柱来进行分离和纯化。

Waters XBridge Protein BEH色谱柱作为一种先进的工具，能够提供快速、高效、稳定的蛋白质纯化解决方案。

1.2 文章结构本文将对Waters XBridge Protein BEH色谱柱进行详细介绍，并提供使用说明和操作技巧。

首先，我们将概述该色谱柱的基本情况，包括其结构和特点。

接着，我们将讨论该色谱柱的工作原理，并阐述其在不同应用领域中的优势和适用性。

然后，我们将详细介绍如何准备样品并装载到色谱柱中，以及如何设置合适的色谱条件来实现最佳分离效果。

最后，我们将介绍一些注意事项、常见问题解答以及安全须知与储存要求。

通过阅读本文，读者能够全面了解Waters XBridge Protein BEH色谱柱的使用方法，并能够在实验中取得准确可靠的结果。

1.3 目的本文旨在向用户提供关于Waters XBridge Protein BEH色谱柱的详细说明，帮助用户正确并高效地使用该色谱柱进行蛋白质纯化。

我们希望通过本文的阐述，读者能够深入了解该色谱柱的特点和应用领域，并能够根据具体实验需求，熟练掌握样品准备、色谱条件设置以及数据分析与结果解读等技巧，从而为自己的科研工作或制药生产提供有力支持。

2. Waters XBridge Protein BEH色谱柱2.1 色谱柱概述：Waters XBridge Protein BEH色谱柱是一种高性能液相色谱（HPLC）柱，主要用于蛋白质和肽段的分离和纯化。

该色谱柱具有独特的粒径和孔隙结构，能够提供出色的分离效果和样品回收率。

2.2 工作原理：Waters XBridge Protein BEH色谱柱采用亲水性强的氢化硅胶作为填料材料，通过调节流动相中溶剂成分和温度等条件，实现对不同蛋白质和肽段的选择性分离。

液相色谱柱使用原则和waters超高压柱特点1、何谓常规反相色谱柱？那些在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱调料所装的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。

反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C18柱是最常使用的反相色谱柱之一。

2、新色谱柱开启和安装的推荐步骤：1、使用新鲜洁净的水与乙腈。

冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

2、取用色谱柱时避免磕碰掉落。

3、将色谱柱入口端接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头表明正确流向。

4、在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。

5、当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。

6、重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。

7、参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。

8、测试柱效。

注：1、当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径（如0.005或0.12mm）的系统管路。

确保管路与色谱柱连接恰当，无死体积。

2、当使用小颗粒填料（如2.5um）短柱进行高效快速分离时，需要考虑一下因素：1）、确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；2）、提高采样频率至10点/秒以上；3）、较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况条件流速；4）、可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。

使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45℃或者更高。

3、进行实际样品分析的推荐步骤：1、确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。

1目录I. 简介II. 入门指南III.色谱柱使用a. 样品制备b. pH 范围c. 溶剂d. 压力e. 温度IV. 色谱柱清洗、再生和存放V.eCord 智能芯片技术 VI.其他信息VII.注意事项I. 简介非常感谢您选择Waters™ XBridge™ XP 和/或XBridge Premier BEH 色谱柱。

XBridge BEH 填料由通过cGMP 和ISO 9001认证的工厂使用超纯试剂生产。

每批XBridge BEH 填料均采用酸性、碱性和中性分析物进行了色谱分析测试，并依据窄范围的技术指标进行质量控制，确保色谱柱具有可重现的理想性能。

每根色谱柱都经过单独测试，并由eCord™智能芯片提供性能色谱图和批次分析证书。

XBridge Premier BEH 色谱柱提供带或不带VanGuard™完全集成技术[FIT]保护柱两种规格。

VanGuard FIT 保护柱专为延长分析柱使用寿命而设计，可防止不需要的样品基质或颗粒物进入色谱柱，而不会影响分离性能。

保护柱可轻松更换，以便恢复分离性能，延长分析柱的使用寿命。

此外，XBridge Premier BEH 色谱柱采用创新的MaxPeak™高性能表面技术，能够尽量减少分析物/表面相互作用，避免可能因此造成的样品损失，从而提高分析物回收率、分析灵敏度和重现性。

XBridge XP 和XBridge Premier 2.5 µm BEH 色谱柱a. eCord 安装b. 色谱柱安装c. 色谱柱平衡d. 初始柱效测定e. 色谱柱QR 码f. XBridge XP 色谱柱 - VanGuard 保护柱g. VanGuard FIT 保护柱a. 清洗与再生b. 存放a. 简介b. 安装c. 生产信息d. 色谱柱使用信息a. 延长ACQUITY BEH 色谱柱 使用寿命的技巧b. BEH HILIC 色谱柱入门c. BEH Amide 色谱柱入门II. 入门指南每根XBridge BEH 色谱柱的色谱柱包装盒或eCord 智能芯片中都随附COA 报告和性能测试色谱图。

XBridge™色谱柱专门为液相色谱方法开发和快速纯化而设计，用户能够在整个pH范围内使用种类多样的流动相体系和很宽的温度范围进行方法开发，从而建立稳定耐用的分析方法。

XBridge OBD™制备色谱柱在高pH条件下分离和纯化碱性化合物能够得到更高的纯度，并且上样量可提高几十倍。

XBridge色谱柱具有非常稳定的性能和更长的寿命，即使在最苛刻的条件下。

它采用革命性的创新技术生产，而且按照行业内最严苛的质量标准进行质量控制，因此成为用户针对挑战性色谱分离的值得信赖的解决方案。

XBridge色谱柱具有如下优势
∙HPLC方法无间隙转换到UPLC®
∙极端pH条件下的更长的寿命和可靠性
∙OBD制备柱的卓越性能
XBridge 色谱柱的特性参数。

常见液相色谱柱性能比较一、高性能色谱柱特点：柱效高，价格高，通用性好，使用寿命长，pH范围宽1、Waters公司Xbridge2005年waters公司推出，杂化颗粒柱。

优点：pH 1-12,在高pH状态下，没有能与此色谱柱匹敌的，目前市场的宽pH色谱柱在高pH的状态下（9-12）普遍寿命很短，如Gemini，资生堂公司Capcell，YMCPro-C18，包括waters的第一代杂化柱Xterra都是寿命不长，Zorbax Extend更是不堪。

柱效与一流的硅胶柱相当，甚至有过之无不及，杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问题在于柱效，Xterra和常见的PSDVB的色谱柱都有不错的pH范围，但是柱效低的问题无法解决，这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。

在如此宽的pH范围，最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法（pH1-3,pH9-12），这样能得到更稳定更容易重现的方法，对酸性，中性，尤其是碱性化合物都能得到理想的峰形。

注：Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料，只是颗粒度是1.7um，所以不再重复。

缺点：价格高，平均每支￥7000多的，不是大多数中国客户可以接受的。

2、MerckChromolith整体化色谱柱Merck公司2001年推出。

优点：高流速、低压力，可以快速分析样品，因为压力低，所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题，低压力是因为硅胶棒的大量中孔的存在，中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵，在处理比较脏的样品的时候会优势很大（如中药），实际的寿命也因此延长。

这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快，特别适合之前分析时间超长的实验条件，目前很好的例子就是人参的指纹图谱，因为成分复杂，之前出峰要2个小时，现在用整体化色谱柱30min就可以分析完了（已有报导），且不影响柱效，类似于UPLC，但不像UPLC那么容易堵。

缺点：规格单一，单价比较高，单价￥7000左右，所以通过串联获得更高柱效的方式显得比较奢侈。

非常感谢您选择Waters XBridge™色谱柱。

XBridge™填料设计精良，能在酸性和碱性流动相条件下获得良好的峰形、达到高柱效并展现出色的稳定性。

所有XBridge™填料均由通过cGMP和ISO 9001: 2000认证的工厂使用超纯试剂生产。

每批XBridge™填料都采用酸性、碱性和中性分析物进行了色谱测试，结果均符合严格的合格标准，可确保色谱柱具有出众的重现性能。

每根色谱柱都经过单独测试，并随附性能测试色谱图以及合格证书。

目录I. 入门指南a.色谱柱安装b.色谱柱平衡c.初始柱效测定II. 色谱柱使用a. 保护柱b.样品制备c. pH操作限值d.溶剂e.压力f.温度III. 放大/缩小等度方法IV. 故障排除V. 色谱柱清洗、再生和储存a.清洗与再生b.储存VI. 将色谱柱连接到HPLCa.色谱柱接头和系统管路注意事项b.测量系统谱带展宽体积和系统方差c.测量梯度延迟（或延迟体积）VII. 其他信息a.使用窄径（3.0 mm内径）色谱柱b.谱带展宽体积对2.1 mm内径色谱柱性能的影响 c.未优化和优化LC/MS/MS系统对比：系统配置更改建议d.沃特世小粒径(2.5 µm)色谱柱 - 快速色谱分离e. XBridge HILIC色谱柱入门f. XBridge Amide色谱柱入门XBridge色谱柱I. 入门指南每根XBridge™色谱柱都附带一份COA报告和一幅性能测试色谱图。

COA报告为XBridge™色谱柱中所用的填料批次所特有，包括批号、未键合颗粒和键合填料分析结果，以及色谱结果和检测条件。

性能测试色谱图提供每根色谱柱的以下信息：批号、色谱柱序列号、USP理论塔板数、USP拖尾因子、保留因子以及色谱条件。

这些数据应妥善保存，以备将来参考。

a. 色谱柱安装注：下述步骤给出的流速适用于粒径5 µm、内径4.6 mm的典型色谱柱。

用户可根据所安装XBridge™色谱柱的内径、柱长、粒径 和柱压相应地提高或降低流速。

Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择2016-04-25 Bruce Lee生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。

目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。

Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。

Figure 1 Waters Symmetry column familyFigure 2 Waters Sunfire column familySymmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。

两个系列均采用封端技术，Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。

Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um，其设计用途为制备；Symmetry300 C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300 C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。

Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会出现孔隙内去湿现象，对于分析碱性等大极性分析物而言，减少其保留能力，改善峰形，具有很高的方法重现性。

如何选择理想的 HPLC分析柱 HPLC分析柱©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation1如何看待色谱柱？色谱柱是液相色谱工作的最重要又最常使用的工具对工具了解越多，越有可能尽早选对合适的工具，使工作开展的更顺 利工欲善其事，必先利其器！©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation2沃特世价值所在： 技术能力+品质保障+专业服务Better traceability & control of the entire processWaters©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011• Manufactures under cGMP, ISO 9001 and ISO 13485 guidelines • Registered with FDA as a medical device manufacturer©2011 Waters Corporation 3概要如何认识色谱柱？ 如何认识色谱柱？ 沃特世色谱柱： 沃特世色谱柱：为色谱工作者的任务而设计 XBridge Atlantis SunFire XSelect UPLC—HPLC方法转换 HPLC—OBD 制备柱无优放大©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation4沃特世色谱柱： 专为色谱分析工作者所需而设计宽pH范围、耐受性最强、最通用的色谱柱增强极性化合物保留的专用硅胶色谱柱高容量、峰形柱效最优化的通用硅胶色谱柱宽选择性覆盖、LCMS方法开发的首选色谱柱©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation5应对耐受性、通用性的需求色谱工作者的需求： 工作者的需求：方法在高pH条件下！！ 方法在较高温度条件下！！ 耐受性？！ 通用性？！2.5, 3.5, 5, 10 µm柱效？！ 样品复杂难以分离？！ 需要各种键合相？ 需要各种柱规格？©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation6高pH耐受性对碱性化合物的分析特别有利 —分离选择性、方法耐受性与柱使用寿命©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation7XBridge： 基于第二代杂化颗粒技术BEH (Bridged Ethylene Hybrid)硅氧骨架中嵌入亚乙基桥- pH范围耐受更宽 - 机械强度更高 - 柱效佳U.S. Patent No. 6,686,035 B2©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788©2011 Waters Corporation8增加化合物的保留并提高灵敏度： High pH Mobile phase2HIGH pH0.1% NH4OH3 6 1 4Morphine Morphine-3ß–o-glucuronide 10-hydroxymorphine5% 00.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80LOW pH0.1% HCOOHCompounds 1. % 10-hydroxymorphineMorphine-6ß–o-glucuronide6 4,5 2 1 32. 3.Morphine-3β-D-glucuronide Morphine-6β-D-glucuronide4. 5. 6. Morphine Morphine N-oxide 6-acetylmorphineMorphine N-oxide0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©20116-acetylmorphineMinutes©2011 Waters Corporation9XBridge —耐受性最强、最为广泛适用2.5, 3.5, 5, 10 µm 1.7 µm耐受性最强、最为广泛适 广泛适用的色谱柱第二代杂化颗粒技术 无以伦比的流动相pH、温度和压力的耐受范围 达到前所未有的柱效、峰形和稳定性水平 广泛的键合相选择，配合各种分析物所需 齐全的柱规格供应，满足各种规模需要©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ©2011©2011 Waters Corporation103NH 3CH +17通过极性嵌入基团保留水 可完全兼容100%水相屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳 提供与C18不同的选择性pH 7.0痢特灵(Furazolidone)原料药的杂质分析实例Ligand type:Trifunctional AmideParticle size:1.7, 3.5 µm Ligand density:7.5 µmol/m 2Carbon load:12% Endcap style:NonepH range:2-11Ligand type:UnbondedParticle size:1.7, 2.5, 3.5, 5 µm Ligand density:— Carbon load:— Endcap style:— pH range:1-9Minutes123321=0.26=0.25Reversed-PhaseXBridge C 18HILICXBridge HILIC1. 6-acetyl morphineHILIC 可以提供和反相不同的分离选择性应用于生物医药行业的：—肽的反相分析与分离纯化—小蛋白药物的反相分析—寡核苷酸的离子对反相分析与分离纯化杂化颗粒，无以伦比的流动相pH与温度的耐受性完整的方法与应用资料，整体方案专用柱，经肽谱、蛋白混标或寡核苷酸阶梯混标质控确保批次重现性工作者的需求：：解决色谱工作者的需求2.5,3.5, 5, 10 µm 适用于高pH方法！！耐受较高温度条件！！耐受性极佳！通用性好！柱效高！多种键合相、多种柱规格适应各种项目需要！色谱工作者的需求和问题：越来越多的极性化合物项目！ 极性化合物的保留难？！离子对试剂应用不便！峰形？！柱耐受性？！1. Thiourea2. 5-Fluorocytosine (B)3. Adenine (B)4. Guanosine-5'-monophosphate5. Thymine注：所示色谱柱性能比较情况，与具体操作条件相关，并不代表所有应用情况（法律申明）增强极性化合物保留的专用色谱柱—首选Atlantis T3反相保留反相保留极性化合物首选：提高保留，避免使用离子对试剂 提供pH 2-8全范围的完美峰形 低pH 条件下的耐受性强，柱寿命好积极应对色谱工作者的问题：增强对极性化合物的保留！ 简便的反相条件！ 峰形佳！ 柱耐受性好！ 广受认可与赞誉！色谱工作者的需求和问题：柱效？！柱容量？！载样量高？！中-低pH条件下碱性化合物拖尾严重？！ 样品杂质或相关物质分析及分离？！51V o 234Symmetry ®C 185 µm USP T f = 1.69N = 696151V o234以Amitriptyline （峰5）计算拖尾因子USP T f pH7条件下SunFire™C 185 µm USP T f = 1.26N = 8203MinutesZorbax®SB C18Luna®C18(2)SunFire™C 18Time (minutes)246810Conditions : 3 µm, 3.0 x 150 mm 28:72 乙腈/ 20 mM 甲酸; 0.7 mL/min; 30 °CSN NNOHCl在方法开发过程中，峰拖尾会对任何特定含量方法影响其分离度与灵敏度。

1、何谓常规反相色谱柱？那些在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱调料所装的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。

反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C18柱是最常使用的反相色谱柱之一。

2、新色谱柱开启和安装的推荐步骤：1、使用新鲜洁净的水与乙腈。

冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

2、取用色谱柱时避免磕碰掉落。

3、将色谱柱入口端接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头表明正确流向。

4、在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。

5、当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。

6、重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。

7、参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。

8、测试柱效。

注：1、当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径（如0.005或0.12mm）的系统管路。

确保管路与色谱柱连接恰当，无死体积。

2、当使用小颗粒填料（如2.5um）短柱进行高效快速分离时，需要考虑一下因素：1）、确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；2）、提高采样频率至10点/秒以上；3）、较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况条件流速；4）、可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。

使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45℃或者更高。

3、进行实际样品分析的推荐步骤：1、确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。

亲水作用色谱柱型号
1. Waters XBridge BEH Amide，该色谱柱是一种亲水作用柱，具有较高的分离效能和较宽的pH范围（2-11）。

适用于分离极性化合物、药物代谢产物等。

2. Agilent ZORBAX Eclipse Plus HILIC，该色谱柱采用独特的亲水作用机理，适用于分离极性化合物、水溶性维生素等。

具有较好的稳定性和重复性。

3. Phenomenex Luna NH2，该色谱柱是一种氨基亲水作用柱，适用于分离极性和非极性化合物。

具有较高的分离效能和较宽的pH 范围。

4. Merck SeQuant ZIC-HILIC，该色谱柱采用亲水作用机理，适用于分离极性化合物、多肽、糖类等。

具有较好的耐久性和稳定性。

5. Shimadzu Shim-pack HILIC，该色谱柱适用于分离极性化合物、药物代谢产物等。

具有较好的分离效能和较宽的应用范围。

需要注意的是，选择适合的亲水作用色谱柱型号应根据具体的分析需求、样品性质和分离要求来决定。

此外，还应考虑色谱柱的尺寸、填料类型、流速等因素，以优化分离效果和分析结果。

总结起来，市场上有多种亲水作用色谱柱型号可供选择，每种型号都有其特点和适用范围。

选择合适的亲水作用色谱柱型号需要综合考虑分析目标、样品性质、分离要求以及色谱柱的性能参数等因素。

hilic色谱柱寡糖hilic色谱柱在寡糖分析中的应用色谱技术作为一种重要的分离技术在许多领域中得到了广泛的应用，其中之一就是在寡糖分析中的应用。

而hilic（Hydrophilic Interaction Chromatography）色谱柱作为一种常用的分离工具，因其对水溶性物质具有较强的保留能力而备受关注。

本文将介绍hilic色谱柱在寡糖分析方面的应用，以及其特点和优势。

一、hilic色谱柱的基本原理和结构特点hilic色谱柱是基于氢键作用的离子交换色谱的衍生物，其分离机制主要是通过溶剂流动模式的改变来调节寡糖的保留和分离。

hilic色谱柱对于带有羟基或氨基的寡糖分子具有较强的保留能力，可实现较好的分离效果。

hilic色谱柱的固定相一般采用亲水性较强的材料，例如对碳链较长的硅胶或磨碎的硅胶。

而流动相则通常选择含有高浓度有机溶剂和高离子强度的缓冲液，用以增加寡糖分子之间的相互作用和保留能力，并实现寡糖的有效分离。

二、hilic色谱柱在寡糖分析中的应用1. 寡糖的定性分析hilic色谱柱在寡糖分析中可以用于寡糖的定性分析。

通过改变流动相的成分和流速，可以控制分离色谱峰的保留时间，进而确定不同寡糖的特征保留时间。

利用这一特性，可以通过与标准寡糖的保留时间比较，对未知样品中寡糖的种类进行鉴定。

2. 寡糖的定量分析hilic色谱柱也可用于寡糖的定量分析。

通过建立标准曲线，确定不同浓度下寡糖的峰面积与浓度的关系，并利用该关系式进行未知样品中寡糖的定量分析。

这种定量方法快速、准确，并且无需复杂的前处理步骤，因此在寡糖分析中具有广泛的应用前景。

3. 寡糖的结构分析hilic色谱柱还可用于寡糖的结构分析。

利用分离效果较好的hilic色谱柱，可以有效地分离具有不同修饰基团或不同链长的寡糖，进而对其结构进行分析。

此外，结合质谱技术，可实现对寡糖的进一步鉴定和结构表征。

三、hilic色谱柱的优势和不足1. 优势hilic色谱柱在寡糖分析中具有一些明显的优势。

水相色谱柱（Waters liquid chromatography column）是一种用于分离化合物的关键仪器。

它们由高质量的材料制成，具有精确的内部结构和精确的尺寸。

水相色谱柱可以用于分离和分析各种化合物，广泛应用于生物化学、制药、环境科学和食品安全等领域。

在本文中，我们将探讨Waters液相色谱柱的结构及其在分析化学中的重要性。

一、Waters液相色谱柱的结构Waters液相色谱柱通常由三部分组成：1. 色谱柱外壳色谱柱外壳通常由不锈钢或其他耐腐蚀材料制成，具有高度的耐压性和耐腐蚀性。

外壳的设计旨在确保色谱柱稳定性和安全性，同时可以容纳色谱填料，并具有进样口和出样口等连接部件。

2. 色谱填料色谱填料是色谱柱的核心部分，一般由多孔陶瓷或有机硅材料制成。

填料的种类和粒径大小会影响色谱柱的分离效果和耐久性。

Waters提供各种类型和规格的色谱填料，以满足不同应用领域的需求。

3. 色谱柱连接件色谱柱连接件是色谱柱的重要组成部分，包括进样口、出样口和连接管道等。

这些连接件通常由高强度的不锈钢或惰性材料制成，以确保色谱分离过程的顺利进行。

二、Waters液相色谱柱在分析化学中的重要性1. 分离和提纯化合物Waters液相色谱柱可以将混合物中的化合物分离开，从而实现对目标化合物的提纯和分析。

在制药和生物化学领域，色谱柱的分离效果直接影响到最终产品的质量和纯度。

2. 分析化合物结构通过调整色谱柱的填料材料和粒径大小，可以实现对各种化合物结构的精确分析。

Waters的色谱柱具有高分离效率和分辨率，能够准确分析复杂混合物中的化合物结构。

3. 色谱柱的选择性Waters提供多种类型和规格的色谱柱，以满足不同化合物和分析方法的需求。

色谱柱的选择性对分析结果的准确性和可靠性有重要影响。

4. 持久稳定性Waters液相色谱柱具有优异的持久稳定性和耐久性，能够在长时间内保持稳定的分离效果。

这对于长时间运行的分析方法和自动化分析系统尤为重要。

各种型号Waters色谱柱使用指南Waters是一家知名的科学仪器制造公司，其色谱柱广泛应用于化学、生物、环境等领域的分析研究。

Waters色谱柱根据不同的分析需求，有多种型号和规格可供选择。

本文将对各种型号Waters色谱柱的使用进行指南，以帮助用户更好地理解和应用这些色谱柱。

1. XBridge 色谱柱系列XBridge色谱柱系列是Waters公司最受欢迎和广泛使用的色谱柱系列之一、它具有优异的耐久性和高效分离能力，适用于各种样品类型的分离和分析。

根据不同的分离模式和分析目标，可以选择不同孔径（1.7、3.5、5、7、10 um）和不同化学改性（C18、C8、Phenyl）的XBridge色谱柱。

使用XBridge色谱柱时，应注意以下几点：-尽量避免使用过高的流速和压力，以免损坏色谱柱。

-在使用之前，应根据样品类型和分析目标选择最适合的色谱柱类型和规格。

-在样品进样之前，应先进行柱平衡，以确保色谱柱的稳定性和重复性。

-根据需要，可以选择柱温控制器进行加热或冷却，以提高分离效果。

2. Acquity UPLC 色谱柱系列Acquity UPLC（超高效液相色谱）色谱柱系列是一种应用于更高效液相色谱系统的色谱柱。

它具有更小的粒径（1.7、2.5 um）和更大的表面积，可以提供更高的分析速度和分离效果。

Acquity UPLC色谱柱适用于对分离效果要求较高、分析时间较短的应用。

在使用Acquity UPLC色谱柱时，应注意以下几点：-使用之前，应确保所使用的色谱柱与液相色谱系统兼容，并进行适当的柱平衡。

-尽量避免在超高压下使用过高的流速，以免损坏色谱柱。

-在样品进样之前，应先进行柱平衡和条件优化，以提高色谱分离效果。

3. SunFire 色谱柱系列SunFire色谱柱系列是一种高性能液相色谱柱，适用于多种样品类型的分离和分析。

它具有优异的化学稳定性和机械强度，适用于各种环境和温度条件下的分析。

在使用SunFire色谱柱时，应注意以下几点：-使用之前，应根据样品类型和分析目标选择适当的色谱柱类型和规格。

waters xbridge protein beh色谱柱使用说明一、引言Waters XBridge Protein BEH色谱柱是一种用于分离和纯化蛋白质的高效液相色谱柱。

本文将详细介绍该色谱柱的使用方法，并说明如何充填和平衡柱子，以及优化分离条件和储存建议。

二、色谱柱的充填与平衡1. 初始准备在充填色谱柱之前，需确认柱子和其他设备已进行有效的清洗和消毒。

请确保所有操作都在洁净和无尘的实验环境中进行。

2. 色谱柱的底部连接将色谱柱的底部与液相色谱系统连接，确保连接紧密无漏。

确认柱子与系统的兼容性以及接口的完整性。

3. 柱子的充填使用适当的方法将柱子充填物均匀地充入色谱柱中。

充填时要小心谨慎，以避免产生气泡或不均匀的充填物分布。

4. 床高检查充填完成后，使用适当的工具测量柱子的床高。

确保床高符合规定，并进行必要的校正。

5. 柱子的平衡连接柱子至液相色谱系统，使用流动相进行柱子的平衡。

按照柱子说明书中的建议流速和平衡时间进行操作。

确保柱子完全平衡以获得稳定和可重复的色谱分离结果。

三、优化分离条件1. 流动相配制根据待分离蛋白质的性质和需求，选择合适的流动相。

通常包括溶剂体系、添加剂和缓冲剂的选择。

确保流动相的配制和pH值调整符合实验要求。

2. 流速优化通过改变流速来优化对待分离蛋白质的分离度和分离时间。

一般来说，较高的流速可提高分离速度，但可能会牺牲分离的分辨率。

根据实际需要进行适当的调整。

3. 温度控制对于某些蛋白质的分离，温度的调控也是必要的。

根据实验要求，选择适当的工作温度和温度控制方法。

4. 采集条件根据分析和应用的不同，选择适当的采集条件来获取所需的色谱峰。

根据具体实验目的，灵活选择分析和监测方法。

四、储存建议1. 柱子的保养每次使用后，根据色谱柱说明书中的建议进行柱子的保养和清洁。

遵循正确的操作规程，确保柱子处于最佳状态。

2. 储存条件当柱子不使用时，将其储存在干燥、阴凉和无尘的环境中。

HILIC色谱柱简介：1. HILIC的概念亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。

它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。

而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

2. HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。

更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。

”HILIC方法开发经验大披露：1. HILIC色谱柱的以waters 公司的HILIC色谱柱为例，分为HPLC和UPLC两种类型，又分为Atlantis，Xbridge，Acquity三个品牌。

填料类型分为BEH，无封尾和Amide填料三种。

2. HILIC色谱柱的应用范普通反向色谱难以保留的物质。

3.HILIC的对化合物的保留原理：亲水性吸附，离子交换和氢键作用。

应用小TIPS：1.HILIC柱如何平衡？HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。

2.HILIC柱如何保存？HILIC柱使用90%的乙腈水溶液保存。

前言：1. 一直使用Waters 的HILIC较多，感觉质量还行，但是要小心waters 的HILIC是分两种类型的填料的BEH HILIC和HILIC。

很多waters 的销售都不清楚之一点。

但是大家一定要注意，这两款的区别是很大的，保留的效果是不同的。

2. 费罗门公司的HILIC柱，感觉是小家碧玉型的，保留能力不是太强，但是清秀文雅，峰型很好看。

3. HILIC的流动相推荐使用乙腈。

4. 推荐使用乙酸铵，这也以后再说。

5.不能使用100% 的乙腈，推荐使用到95%就行了。

不能使用60%一下的乙腈。

所以梯度范围小。

但是足够用了。

因为100%的乙腈可能对HILIC的中亲水的部分不利于键合相的伸展开。