实验一凝胶过滤层析分离蛋白质 ppt课件
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凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即:Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav值增大。
Ve(洗脱体积)为某一成分从加入样品算起,到组分的最大浓度(峰)出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质,它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大(为200万),呈蓝色,它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻,并可借助其本身颜色,采用肉眼或分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)洗脱体积(即Vo)。
但是,在测定激酶等蛋白质的分子量时,不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积,因为它对激酶有吸附作用,所以有时用巨球蛋白代替。
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。
2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即:Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav 值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大(为200万),呈蓝色,它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻,并可借助其本身颜色,采用肉眼或分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)洗脱体积(即Vo)。
但是,在测定激酶等蛋白质的分子量时,宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积,因为它对激酶有吸附作用,所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积(Vi)的物质,可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯,或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白(分子量64,500左右)和二硝基氟苯-鱼精蛋白(DNP-鱼精蛋白分子量12,000左右)的混合物,通过Sephadex G-25层析后达到分离。
实验一酵母蔗糖酶的提取及部分纯化一、实验目的:学习酶的提取和纯化方法,并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
二、实验原理:蔗糖酶(invertase)(β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的β—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶(external yeast invertase), 其活力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶(internal yeast invertase),含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它们的分子量也不同,外酶约为27万(或22万,与酵母的来源有关),内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要是外酶。
三、试剂与器材:1. 试剂:(1)啤酒酵母(2)二氧化硅(3)甲苯(使用前预冷到0℃以下)(4)去离子水(使用前冷至4℃左右)(5)冰块、食盐(6)1N乙酸(7)95%乙醇(预冷至-20℃)2. 器材:(1)研钵1个(2)离心管3个(3)滴管3个(4)量筒50mL 1个(5)水浴锅1个(6)恒温水浴(7)烧杯100mL 2个(8)广泛pH试纸(9)高速冷冻离心机四、操作步骤:1. 提取(1)准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中(两组做一个)。
(2)取适量(5-10g)二氧化硅放入研钵中研细。
(3)称取5g干啤酒酵母放入研钵中,量取预冷的甲苯20mL缓慢加入酵母中,边加边研磨成糊状,约需30分钟,至酵母细胞大部分研碎。