凝胶过滤层析的分类共17页文档

温度控制
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
THANKS
感谢观看
03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子

琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D 半乳糖和 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成 脱水的L 半乳糖连接构成 的多糖链。 多糖链。 这种多糖链在100℃ 左右时呈液态， 这种多糖链在 100℃ 左右时呈液态 ， 当温度下降到 45℃以下时呈固态。 45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
三、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。 它是以甲撑双丙烯酰胺 甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂 交联剂，以过 甲撑双丙烯酰胺 交联剂 硫酸铵作催化剂， 硫酸铵 在N,N,N’,N’,- 四甲基乙二胺(TEMED TEMED)加速剂 TEMED 的作用下， 丙烯酰胺(单体)聚合而成的。 将丙烯酰胺 丙烯酰胺 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产 物。
2．稳定性 ．
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中 是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其 性质并不改变。 在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中 浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。

葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样
分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的

凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。

42
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
43
一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
36
（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
21
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
22
2 规格型号：

因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。

当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。

3．吸附性

葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。


中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。

CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。

特点：
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶

的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。
琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。
琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％) 和6B(6％)。
玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不 受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。
第二节 基本原理
凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的 物质。
排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自 由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0~100％之间。
一、凝胶的选择和处理
1．凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。
Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。
一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大， 分离的效果越好。
(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果
在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范 围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂 (如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分 离效果。
此凝胶共有6种类型，详见表6-6
除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。