胚胎冷冻保存
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胚胎冷冻原理
胚胎冷冻原理当科技进步到一定程度时，胚胎冷冻技术便应运而生。
胚胎冷冻是指将受精卵或初期胚胎置于低温环境下，储存起来，以便未来使用。
这项技术不仅帮助那些在生育时遭遇不孕不育的夫妇，更为科学界的发现提供了便捷的途径。
胚胎冷冻的整个过程可以分为以下几个步骤：第一步，收集和准备健康的卵子和精子。
在体外受精的过程中，取出卵子和精子，然后将它们培养在培养皿中，以促进受精卵的发育。
第二步，收集和冷冻受精卵。
将受精卵贴在培养皿上，按照标准程序进行操作。
在发育的早期，胚胎会被收集并放置在低温的液氮中，这会停止胚胎的发育，使其进入休眠状态。
第三步，储存和保护。
使用液氮条码系统来确保胚胎的标识和储存信息，以避免混淆和损失。
胚胎在常规下是能够存储5年，但在特定情况下或新技术和研究的发现，其保存时间或可延长。
胚胎冷冻可以帮助那些需要辅助生殖技术的夫妇。
例如，一些女性因年龄或疾病等原因而不能自然怀孕，或许可以将他们的受精卵冷冻下来，以备不时之需。
此外，对于那些必须接受放疗或化疗的患者，他们还可将备用胚胎存储在里面，用于将来他们生育孩子的可能性。
同时，胚胎冷冻也为科学研究提供了全新的方向。
有些科学研究无法在体外进行，因为某些特定的细胞只在某些发育阶段生存。
通过冷冻胚胎，科学家就可以拥有这些细胞并在适当的时间点解冻以进行研究。
然而，胚胎冷冻技术也存在一些争议，其中最主要的是胚胎的生命可形成。
有些人认为，在冷冻过程中，胚胎会被暴露在液氮所引发的极寒温度下，这可能导致损伤甚至死亡。
因此，他们反对这种技术并呼吁立即禁止它。
总之，虽然存在着一些争议，但胚胎冷冻技术仍是一项非常重要的科学技术。
它为那些需要帮助实现生育的夫妇提供了新的选择，并为科学研究提供了独特的途径。
我们需要继续关注这项技术的发展和应用，并逐步完善它。
胚胎冷冻保存
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平 衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中 冷冻保存。
胚胎玻璃化冷冻
（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护 剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性 强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利 于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎 细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶 液；
在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～
100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)， 两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透 过性抗冻剂。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻 璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透
过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化
胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术嘿，朋友们！今天咱来聊聊胚胎冷冻保存技术。
这玩意儿可神奇啦，就好像给胚胎找了个超级“冰库”，让它们能在合适的时候再出来“闪亮登场”。
你想啊，这胚胎就像是一颗小小的种子，蕴含着无限的可能。
而胚胎冷冻保存技术呢，就是给这颗种子提供了一个特殊的保护罩。
把胚胎冷冻起来，等需要的时候再解冻，让它继续成长发育，这多厉害呀！很多人可能会问，为啥要搞这个胚胎冷冻保存呀？那用处可大了去啦！比如说，有些夫妻想要孩子的时候，身体条件不太好，这时候就可以先把胚胎冷冻起来，等调理好身体了再让胚胎复苏。
这就好比把好东西先存起来，等自己有能力享受的时候再拿出来，多机智呀！还有啊，有些女性可能因为某些疾病，需要先进行治疗，但又担心以后生育受影响，这时候胚胎冷冻保存就是她们的“大救星”。
这技术操作起来也挺有意思的。
医生们就像魔法师一样，小心翼翼地把胚胎处理好，然后放进专门的冷冻设备里。
这个过程可不能马虎，稍有不慎，这颗“小种子”可能就受委屈啦！不过别担心，咱们的医生那都是专业的，他们肯定能把胚胎照顾得好好的。
冷冻后的胚胎就乖乖地在“冰库”里待着，等着被唤醒的那一天。
等时机一到，医生就会把它们解冻，让它们重新开始生长。
你说神奇不神奇？就好像它们睡了一觉，醒来后还是活力满满。
当然啦，这可不是随随便便就能做的。
在进行胚胎冷冻保存之前，医生会和患者进行详细的沟通，了解各种情况。
毕竟这是关系到一个新生命的事情，可不能马虎呀！而且，冷冻保存也不是一劳永逸的，还需要定期检查和维护，就像我们要经常保养自己的爱车一样。
说真的，胚胎冷冻保存技术给很多人带来了希望。
那些曾经因为各种原因担心不能拥有宝宝的家庭，现在有了新的选择。
这难道不是一件很棒的事情吗？总之呢，胚胎冷冻保存技术就是现代医学的一个奇迹。
它让生命有了更多的可能，让那些渴望孩子的家庭看到了希望的曙光。
咱可得好好感谢那些研究出这项技术的科学家们，是他们让这个世界变得更加美好。
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用动物配子和胚胎冷冻保存是一种通过低温保存方式，将动物种子或胚胎保存在玻璃管或冷冻盒中，以便在未来的时候将其恢复生长和繁殖的技术。
动物配子或胚胎保存可以保证物种的遗传多样性，也可以为动物的保护和培育提供重要的帮助。
近年来，该技术在畜牧业、医学研究以及保存濒危物种等领域得到了广泛的应用。
动物配子和胚胎冷冻保存的原理是通过低温抑制生命体内的活动代谢，达到延缓历程的效果。
在冷冻过程中，配子和胚胎的内部液态会转变成固体所以需要添加抗冻剂来保护细胞和避免冰晶对细胞的伤害。
当冷冻被完成后，这些细胞或组织可以存储在超低温（通常为-196℃）下，以防止它们继续生长或衰老。
当需要将它们恢复到正常生长时，需要将保存的胚胎或配子慢慢加热到它们适合的温度以使其重新开始细胞代谢。
在畜牧业中，动物配子和胚胎的冷冻保存技术被广泛应用。
通过把高质量的家畜的配子和胚胎冷冻保存，可以在未来种群扩增 or 培育需要的时候母猪、牛、马和羊的种群扩增。
生物学家利用高质量的胚胎和配子创建基因改良动物，然后将其冷冻保管。
当需要在生产中培育更多的种群，在需要时就可以于提取原料，并将它们放入深度冷冻中进行保存。
这a对于种群扩增而言是非常重要的工具。
在医学研究领域中，无论是用于治疗不育症，还是利用它来治疗人造生殖植入，动物的配子和胚胎保存技术都是非常重要的技术。
这些技术可以为什么人造受孕程序创建可靠的储备源，这些储备源可以在不必要的情况下补充供体实验。
在保护濒危动物种群和保护野生动物方面，动物配子和胚胎保存技术也有着重要的作用。
通过采集、保存和重新植入野生动物或濒危动物的配子和胚胎，可以创建并保护优良的纯种，有效地保护某些濒危物种。
总之，动物配子和胚胎保存技术为畜牧业、医学研究和濒危物种的保护提供了可靠的参考。
虽然这项技术需要高度技术，但相信经过不断学习和研究，将来它将起到越来越重要的作用。
胚胎冷冻保存知情同意书
【合同标题】胚胎冷冻保存知情同意书
【合同分类】医疗服务合同
【发文字号】
【发布机构】
一、体外受精—胚胎移植一般移植3—4个胚胎，剩余的胚胎经程序冷冻后投入到－196.C液氮中保存，胚胎冷冻保存最长时间为8年。
冷冻胚胎解冻会有一定比例的损伤，而且解冻胚胎的妊娠率低于新鲜胚胎。
每过一年须补交____元保存费，若过期未交费本中心有权自行处理胚胎，恕不另行通知。
二、本人已知晓上述内容，愿遵守关于胚胎冷冻保存的上述协议。
患者（签字）：____ 患者家属（签字）：____
____年####月####日____年####月####日
谈话医生（签字）：____
____年####月####日。
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景_孙志宏
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景延安大学生命科学学院(延安716000) 孙志宏 马 莉 周茂林 综述 李延清 审校 1983年Tr ounso n等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。
目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。
本文就胚胎冷冻技术基本原理、研究进展与应用前景做一综述。
1 胚胎冷冻保存原理及其损伤机制1.1 胚胎冷冻保存原理 冷冻保存(cr yo peserv ation),是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速度降至零下某一温度,对其长期保存的过程[2]。
此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,从而达到长期保存的目的。
胚胎冷冻技术是在精子冷冻保存的基础上发展起来的。
冷冻胚胎存活率是渗透压和低温损害积累结果的反映。
冷冻保护液的浓度和植冰温度之间确定最适宜的关系是保证冷冻胚胎存活的关键因素[1]。
1.2 胚胎冻存的损伤机制 胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程,冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。
正常胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中,胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶,一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤(ice damag e),另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高,造成蛋白质变性即溶液损伤(solutio n damag e),二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡。
但是,如果在胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的冷冻保护剂如甘油、DM SO、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤[3-4]。
冷冻保护剂的成分通过细胞膜进入细胞内,细胞内外冷冻保护剂和其它溶质达到平衡,同时细胞脱水形成玻璃化的凝固状态,该过程是胚胎冷冻最重要的保护机制。
解冻时,冷冻保护剂渗出细胞外,同时细胞膜必须防止水过多过快渗人细胞内,以免发生渗透性膨胀。
2 冷冻保护剂的种类极其作用机制 在胚胎冷冻和解冻过程中的适当阶段添加适当浓度的冷冻保护剂能有效地降低对细胞的损伤,科学选用冷冻保护剂在胚胎冷冻保存过程中非常重要[5]。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、丙二醇等。这 些物质可以渗透到细胞内，降低细胞内的冰点，从而减少冰晶的形成。
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
THANKS
感谢观看
温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
THANKS
感谢观看
温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
胚胎冷冻技术流程
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在进行胚胎冷冻之前，需要进行充分的准备工作。
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精 子为单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二 极体的排出，新陈代谢逐步加强）。 胚胎孕育着新的生命（娇嫩）。
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
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• 以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮； • 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； • 以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分
充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞 内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏 性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。
常规冷冻法
（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室 温或37℃水浴中解冻。
（5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎
有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会 伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液， 进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入 低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等 渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培 养。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻
璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透 过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化 学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻 剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎 在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～ 100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
常规冷冻程序
• 从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中:
1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS
• 装入细管 (编号预先准备好) • 放入冷冻容器 -6.0℃ • Seeding ice • 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 • 放入液氮容器
胚胎玻璃化冷冻
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢 出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚 胎造成致命的机械损伤。
胚胎冷冻保存方法
⑴ 常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过
快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎 过分脱水而产生溶质效应。
⑵ 超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱
水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。
⑶ 玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外
液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近， 控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚 胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成 玻璃体，直接投入液氮保存。
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。
基础液： mPBS（改良）、 ，最常用mPBS。
抗冻剂的种类及作用
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚胎冷冻保存
胚胎冷冻保存的基本概念
将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存 的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新 技术，是胚胎移植技术的重大突破。
胚胎冷冻保存的意义
• 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚 胎移植技术的效率； • 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施； • 便于国际间交流； • 替代种畜引种。
玻璃化溶液（VS）： • 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内
部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 • 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以 防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致 使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内 封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法 诱发结冰。
常规冷冻法
（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓 慢降温。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤
⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液 形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部 的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。
⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶 质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的 一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。
• 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有
1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经 10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上 端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制 性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。
玻璃化溶液（VS）： • 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内
部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 • 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
抗冻剂的种类及作用
⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO 等，防止溶质效应。 特点：分子量小于100，易于渗透
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，
降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使
胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形
成。
特点：分子量大，不进入细胞
充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞 内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏 性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。
常规冷冻法
（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室 温或37℃水浴中解冻。
（5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎
有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会 伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液， 进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入 低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等 渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培 养。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻
璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透 过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化 学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻 剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎 在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～ 100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
常规冷冻程序
• 从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中:
1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS
• 装入细管 (编号预先准备好) • 放入冷冻容器 -6.0℃ • Seeding ice • 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 • 放入液氮容器
胚胎玻璃化冷冻
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢 出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚 胎造成致命的机械损伤。
胚胎冷冻保存方法
⑴ 常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过
快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎 过分脱水而产生溶质效应。
⑵ 超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱
水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。
⑶ 玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外
液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近， 控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚 胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成 玻璃体，直接投入液氮保存。
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。
基础液： mPBS（改良）、 ，最常用mPBS。
抗冻剂的种类及作用
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚胎冷冻保存
胚胎冷冻保存的基本概念
将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存 的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新 技术，是胚胎移植技术的重大突破。
胚胎冷冻保存的意义
• 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚 胎移植技术的效率； • 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施； • 便于国际间交流； • 替代种畜引种。
玻璃化溶液（VS）： • 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内
部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 • 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以 防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致 使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内 封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法 诱发结冰。
常规冷冻法
（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓 慢降温。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤
⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液 形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部 的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。
⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶 质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的 一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。
• 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有
1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经 10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上 端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制 性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。
玻璃化溶液（VS）： • 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内
部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 • 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
抗冻剂的种类及作用
⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO 等，防止溶质效应。 特点：分子量小于100，易于渗透
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，
降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使
胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形
成。
特点：分子量大，不进入细胞