关于慢病毒感染的相关知识总结讲解

A&Q|慢病毒感染问题全解答慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

它可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，可有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，所以慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，能够方便快捷地实现基因的长期、稳定表达。

在使用慢病毒的过程中，可能因病毒的浓度、细胞的状态、操作规范和时间把握等出现各种问题，今天小恒就来和大家聊一聊在其中可能会遇到的问题，以及如何解决这些问题~1.对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡，是否说明病毒有毒性?首先，确定病毒是否有支原体或细菌污染；其次，确定病毒感染MOI是否过高，梯度稀释后感染，寻找合适的MOI。

同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。

病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。

如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转2.病毒感染目的细胞效率低?和以下几个因素有关◆病毒活性解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融，-80℃保存半年以上需要重新测滴度；◆目的细胞最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。

一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等，或者体内动物实验适合用腺病毒或AAV；◆当然也和MOI值、感染时间以及是否加入polybrene等因素有关，可在实验中进行实当的摸索和调整，提升慢病毒的感染效率3. 如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间？慢病毒感染细胞后2~3天可观察慢病毒携带的基因荧光表达情况，在细胞汇合度30~50%且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度。

3.用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种4.慢病毒感染后什么时间基因表达到峰值慢病毒感染后大部分细胞会在3天左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。

慢病毒原理慢病毒，又称慢性病毒，是一类感染机体后具有长期潜伏期的病毒。

与急性病毒不同，慢病毒具有较长的潜伏期和慢性发展过程，因此对人类和动物健康造成了长期的威胁。

慢病毒的原理主要包括传播途径、感染过程和致病机制。

首先，慢病毒的传播途径多样，主要包括血液传播、性传播、母婴传播和空气传播等。

其中，血液传播是慢病毒最为常见的传播途径之一，例如艾滋病病毒（HIV）通过血液传播是造成艾滋病的主要原因之一。

另外，慢病毒还可以通过性接触、母婴垂直传播和呼吸道飞沫传播等途径传播，因此在预防和控制慢病毒感染方面需要采取多种有效的措施。

其次，慢病毒的感染过程相对复杂。

一般来说，慢病毒感染后会经历潜伏期，这段时间内病毒在宿主体内进行潜伏和复制，但并不引起明显的临床症状。

随着时间的推移，病毒逐渐破坏宿主的免疫系统和器官组织，最终导致慢性疾病的发生。

以乙型肝炎病毒为例，感染者在潜伏期内往往没有明显症状，但长期感染会导致肝脏损伤，甚至引发肝硬化和肝癌等严重后果。

最后，慢病毒的致病机制涉及多个方面，包括病毒的侵入、复制和传播，以及宿主免疫系统的应答和病理损伤等。

病毒侵入宿主细胞后，利用细胞内的生物合成机制进行复制，不断增加病毒颗粒的数量。

同时，病毒的复制和蛋白质的表达会诱导宿主免疫系统的应答，但慢病毒往往能够逃避宿主的免疫攻击，导致病毒长期存在于宿主体内。

此外，慢病毒的复制和病理变化还会引起宿主组织的炎症反应和器官功能损伤，最终导致慢性疾病的发生和发展。

综上所述，慢病毒的原理涉及传播途径、感染过程和致病机制等多个方面，对于预防和控制慢病毒感染具有重要意义。

因此，加强对慢病毒的研究和监测，制定科学有效的防控策略，对于维护人类和动物健康具有重要意义。

慢病毒——基因转移的潜在新载体用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。

目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，但是这些载体均存在不足之处，严重影响了基因治疗的有效性及安全性。

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。

慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。

现以HIV-1 为例，就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等方面作一综述。

一、慢病毒载体的生物学特征慢病毒包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ，以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。

目前，HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体，而其中又以H I V-1最为热门。

1.1H I V-1病毒形态与结构成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(proteas e)。

HIV-1的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。

包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ，包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。

（若有条件在电镜下观察经多质粒系统制备成功的慢病毒颗粒，是否有利于慢病毒的多质粒包装工艺？）1.2H I V-1病毒基因组结构及其功能特征 HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。

慢病毒的生物学特性及其致病机制慢病毒是一类具有强烈致病性的病毒，它们以极慢的速度破坏宿主正常生理功能、繁殖和分化能力，导致疾病的发展和进展。

与普通病毒比较不同的是，慢病毒在宿主体内可以持续存在很长时间，这增加了患者治疗和康复的难度。

1. 慢病毒的分类和基本结构特征慢病毒广泛存在于自然界中的哺乳动物、鸟类等多种生物中。

它们属于反转录病毒，具有某些细菌和动物毒素中没有的结构和特征。

慢病毒的病原体和感染机理十分复杂，不同种类的慢病毒具有不同的结构和基因组组成。

慢病毒的基本结构特征是具有外包膜和筛状结构的核糖体。

它们的外包膜包裹着一个内接膜，在其表面上伸出胞外糖蛋白，使得它们能够识别和与宿主细胞表面的特定受体相互作用。

同时，慢病毒的筛状结构既可以作为病毒基因组RNA的质朴，也可依赖于宿主细胞核酸酶所合成的DNA同步繁殖。

2. 慢病毒在宿主体内的繁殖和扩散慢病毒的开发依赖于它们能够在宿主体内生存并繁殖。

它们通过感染宿主细胞，利用细胞自身的生物合成机制，表示复杂的病毒蛋白和合成病毒基因组。

慢病毒得以在宿主细胞质中主导细胞代谢活动。

慢病毒在宿主体内的繁殖过程是长期缓慢的。

一些类型的慢病毒的复制可以生产DNA和RNA亚基，并且它们需要通过激活受体和核糖体的复杂机制，才能使病毒基因组复制或转录。

这使得慢病毒可以长期依赖于宿主细胞，使宿主体内病毒基因组的拷贝数目不断增加。

3. 慢病毒的致病机制慢病毒的致病机理十分复杂，它们具有多个不同的致病因素，并经常与宿主免疫反应的效应器相互作用。

慢病毒的感染机理包括直接细胞毒性和免疫调节。

慢病毒的直接毒性是指病毒和细胞直接交互可能造成毒性作用。

这是因为慢病毒感染宿主后，其基因组可以和宿主基因组相互作用导致细胞质发生持续性的炎症反应，此时会释放出任何病毒产物。

慢病毒的免疫调节机制是指病毒通过干预宿主免疫反应而导致的病理反应。

慢病毒感染后，会通过感染细胞的多个组织，使得免疫细胞进入炎症灶。

慢病毒的基本原理和应用慢病毒（Slow Virus）是指一种具有长期潜伏期或长期进展的病毒，在宿主体内繁殖较慢，而病程较长的感染性疾病。

慢病毒以肝炎病毒、感能病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）等为代表。

慢病毒是一种特殊的病毒，其感染机制、致病机理和治疗方法都与其他病毒不同。

一、慢病毒的基本原理慢病毒的基本原理可以简单地分为以下几个方面。

1. 慢病毒的潜伏期长。

以艾滋病毒为例，患者感染后，可潜伏多年，甚至10年以上，其间没有任何症状表现。

这就给治疗患病的时机带来了难度，也使得艾滋病具有了很强的传染性。

2. 慢病毒可以长期影响人体的免疫系统。

慢病毒比其他病毒更加复杂，可以在人体内长期生存。

慢病毒通过影响人体的免疫系统，消耗人体的免疫力，使得患者陷入易感染、易发病、病程较长的状态。

3. 慢病毒的感染难以被查明。

由于慢病毒繁殖较慢，对人体产生的毒性较小，因此在感染初期难以快速检测出来。

这也是慢病毒传染性强的原因之一。

二、慢病毒的应用虽然慢病毒对人体的危害不小，但科学家也发现慢病毒也具有较大的疗效。

下面我们来看看慢病毒的应用领域。

1. 肿瘤治疗。

慢病毒呈现的长期作用和稳定的表达是其治疗肿瘤的重要特点之一。

利用载了有效目标基因的慢病毒病毒载体，经过基因修饰而改变其发病机制，可以将慢病毒载体作为介导治疗的载体，将其放置在肿瘤细胞中，从而减少肿瘤细胞的生长。

2. 神经退行性疾病的治疗。

神经退行性疾病是指一类慢性神经系统疾病，常常由于神经元死亡导致，如阿尔茨海默症、帕金森病等。

慢病毒通过基因修饰可帮助人体产生某种神经元离子通道，通过将离子通道放在感觉神经元和中枢神经元上，减少神经元死亡，保护人体神经系统的健康。

3. 病毒基因敲除治疗。

利用了慢病毒的基因敲除能力，将慢病毒转化成人体行为控制器，将慢病毒病毒载体作为载体，递送到患者体内，进行病毒治疗。

通过这种治疗方式，可以更加有效地处理患病问题，避免上述疾病的出现，并显著提高生命质量。

慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。

混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。

慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。

慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

慢病毒的感染机制及其防治策略慢病毒是一类病毒，与传统的快速病毒不同，它们具有慢性感染的特点。

慢病毒的传染途径多样，可以通过血液、性接触、母婴传播等多种途径进行感染。

慢病毒感染后，会在体内潜伏数年甚至十几年，让感染者认为自己身体良好，但在这段时间里，感染者的健康却受到了慢性威胁。

本文将深入探讨慢病毒的感染机制及其防治策略。

一、慢病毒的感染机制1. 慢病毒的侵入过程慢病毒通过多种途径感染人体，其中血液途径是主要途径。

血液是慢病毒侵入人体的突破口。

在日常生活中，如注射毒品使用共享注射器、输血、器官移植、性行为等都会导致血液途径的感染。

2. 慢病毒的感染过程慢病毒的感染过程会受到许多因素的影响，包括病毒浓度、感染途径等。

慢病毒会侵入机体后，进入相关组织细胞，如巨细胞、淋巴细胞等，并在细胞内复制繁殖。

在慢病毒的复制过程中，它们会借助宿主细胞内的特殊机制，如表达特殊的病毒酶，使宿主细胞产生异常代谢，导致慢性病情的发生。

3. 慢病毒的传播慢病毒传播的途径多样，包括母婴垂直传播、血液途径传播、口腔黏膜摩擦等途径。

以乙型肝炎病毒为例，它能够通过血源、婴儿出生时从感染母亲的阴道中得到、疫苗接种时传染等多种途径传播。

二、慢病毒的防治策略1. 留意疫苗接种对于可预防的慢病毒而言，如肝炎B型和人类乳头瘤病毒疫苗，及时接种是精准预防的重要手段。

2. 定期筛查定期进行血液传染病筛查，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒等，可以及时了解自身健康状况，并采取必要的治疗措施。

3. 保证注射器个人使用分享注射器是造成共生性疾病感染的主要原因之一。

因此，在注射药物等行为时，使用个人注射器是非常重要的预防措施。

4. 适度运动和饮食慢病毒感染会使患者出现许多生理和情感问题，运动和饮食等健康生活方式会对提高机体免疫力、降低慢病毒产生和复制等防治病毒的重要作用。

总之，慢病毒是一类长期潜伏的病毒，它们的传播和繁殖方式都很特殊，因此我们需要充分了解和认识慢病毒的感染机制，才能更好地预防和治疗慢病毒相关疾病。

慢病毒原理及注意事项慢病毒介绍慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。

其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

慢病毒具有感染谱广泛特点，并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。

一经感染宿主细胞，慢病毒即利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA，随后永久的整合到宿主细胞的染色体中，实现长时间稳定表达。

此外，慢病毒免疫原性低，不易造成免疫反应，所以现在慢病毒系统除了被广泛应用到各种细胞系的基因敲除/敲入、基因过表达、RNA干扰、microRNA研究，还大量应用于活体动物实验中。

慢病毒注意事项1、病毒转导至细胞后多久才会表达？Lentivirus表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，HEK293等）上，病毒转导24小时后可以观察到荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）荧光蛋白表达时间较长，转导后72-96小时甚至更长时间才可以观察到荧光。

转导后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定病毒对目的细胞的转导情况。

2、慢病毒对目的细胞的转导效率很低，如何提高病毒的转导效率？确保转导之前细胞处于良好的生长状态；可以使用易感细胞如293T进行滴度测试，验证病毒液滴度是否出现大幅下降；适当提高病毒转导的MOI值和延长转导时间。

3、慢病毒转导后，细胞状态很差甚至出现大量死亡，如何解决？转导前细胞状态不佳，加入病毒量太大，病毒携带的目的基因含有细胞毒性均有可能导致目的细胞状态异常，解决方法主要有：（1）稳定转导前细胞状态；（2）降低病毒加入量，降低MOI值，验证目的基因的细胞毒性；（3）转导6小时后观察细胞，如细胞状态出现异常时更换新鲜培养基，若无则24小时后更换。

慢发病毒感染名词解释
病毒感染是指病原体通过侵入寄主细胞，并在寄主体内进行复制和生长的过程。

病毒是一类非细胞有机体，只能在寄主细胞内寄生，并利用寄主细胞的代谢机制进行复制，从而导致细胞破坏和疾病的发生。

病毒感染的过程可以分为以下几个阶段：
1. 侵入：病毒通过进入宿主体内的途径（例如呼吸道、食物摄入、虫媒传播等）进入宿主体内。

2. 寄生：病毒侵入宿主细胞，并通过与宿主细胞表面的受体结合，进入宿主细胞内部。

3. 复制：病毒利用宿主细胞的代谢机制，复制自身的基因物质和蛋白质，从而产生大量的病毒颗粒。

4. 细胞破坏：大量的病毒颗粒释放并感染周围的健康细胞，导致细胞破坏和细胞凋亡。

5. 散布：病毒以多种方式散布到其他宿主体内，传播病毒感染。

病毒感染可以引起不同的疾病，其临床表现根据病毒的种类、感染部位以及宿主个体的免疫状况等因素而各异。

常见的病毒感染包括流感、感冒、肠胃炎、登革热、艾滋病等。

为了预防和控制病毒感染，人们可以采取以下措施：
1. 注重个人卫生：保持良好的个人卫生，包括勤洗手、避免与患者密切接触、避免接触可能污染的物体等。

2. 接种疫苗：根据病毒感染的特点，接种相对应的疫苗，增强免疫力。

3. 避免人群聚集：避免拥挤的场所，减少病毒传播的机会。

4. 注意饮食健康：保持均衡的饮食，增强机体免疫力。

5. 增强免疫力：保持良好的生活习惯，适当进行体育锻炼，多参加户外活动。

总之，病毒感染是一种常见的传染病，可以引起多种疾病。

预防和控制病毒感染是保护个人健康和公共卫生的重要措施。

慢病毒使用操作手册:一、慢病毒的储存与稀释病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时 1.-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于个月，建议在使用前6 ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过需要重新滴定病毒滴度；因此在病毒使用过程中反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10% ②,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细 2.请尽量℃保存含血清或含双抗不影响病毒感染胞用PBS或无血清培养基(()。

混匀分装后4 ) 分装后使用。

在三天内用完In Vitro二、慢病毒用于体外（）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。

慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒值）之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得（In Vivo以及在体。

（使用到合适的感染复数（MOI 值）24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞①）作为平行实验的对照细胞。

(HEK293T，Hela在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，②含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒TU/ml③一般慢病毒单位为88TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10滴度为>1X10个具有生物活性的慢病毒颗粒。

细胞的感染预实验实验前按照不同HEK293T 24孔培养板为例，进行目的细胞和 2. 以和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使MOI的MOI设置不同的感染孔，并根据溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

慢病毒引起的免疫学反应和致病机制慢病毒是一类病毒，其病毒复制和致病过程较慢，具有持续性和潜伏期。

慢病毒感染后可以引起免疫学反应，在机体内不断激发免疫反应，而且会导致组织细胞持续凋亡，最终导致免疫缺损。

具体来说，慢病毒感染后会输出一些蛋白质及其片段、基因型或表型位点或表达的锚定分子、有机分子链、糖链、极性和反极性脂质等作用于宿主免疫系统，从而刺激机体内的免疫细胞参与这个状态的演变。

慢病毒感染的靶细胞主要是生命周期较长的细胞，如神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统等，这些细胞所在的生理界面群具有特殊的生物学特性，可以持久存活。

由于慢病毒比较复杂，感染后可导致长时间持续病变，患者有可能在多年、甚至几十年之后才会发病，医学上将此类疾病称为慢性进展性病变。

慢病毒的致病机制主要有三点：第一是直接感染，由于慢病毒感染的细胞具有极长的生命周期，所以对细胞的破坏将很难自我修复而且常常无法彻底消除，导致炎症反应的连续发生并逐渐加重；第二是自身免疫反应，引起的应答反应极为严重，并导致自身免疫反应，被损坏的组织细胞不断死亡，并引发病理反应，而这种病理反应还可能进一步导致身体免疫缺陷，风险进一步增加；最后是异常代谢物的沉淀和聚集，例如蛋白质、糖质、胆固醇、核酸等，会堵塞细胞通道，并象闭塞性疾病一样引发损伤和破坏，导致损伤显著，并致使组织加温和病变。

在感染慢病毒时，体内会产生两种免疫反应：细胞免疫（Cellular Immunity）和体液免疫（Humoral Immunity）。

细胞免疫主要由T细胞负责，其通过识别并杀死感染慢病毒的病毒或被感染细胞。

T细胞会释放一系列的细胞因子，例如干扰素（Interferon，IFN）、白介素（Interleukin，IL）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）等来抑制病毒的复制，同时也会促进CD8+T细胞、自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞等细胞参与杀伤病毒感染的细胞。

慢病毒常见问题与解答1、慢病毒载体的特点及应用范围？慢病毒载体是有包膜的RNA病毒，可以感染分裂和非分裂细胞（而逆转录病毒只能感染有丝分裂活性的细胞），在感染宿主细胞后不能自我复制。

以水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）包膜G蛋白VSV-G替换野生型包膜蛋白，使重组慢病毒感染范围覆盖了各种传代和原代的肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞，以及干细胞、T细胞等。

2、金开瑞生物的重组慢病毒使用何种系统？金开瑞生物使用第三代慢病毒包装系统，包括3个辅助质粒、1个用于插入目的基因的转移质粒，三个毒粒组装必须的基因（Pol，Gag，Rev）被分开装载于不同的质粒上，包装过程中必须4质粒共转才能成功出毒，最大限度降低了重组概率。

同时三代转移质粒的5’和3’ LTR都删除缺失了野生型的U3，成为不能自我复制的自灭活（SIN）载体。

3、慢病毒载体生物安全性如何？重组慢病毒载体已经删除了所有野生型毒性基因，感染细胞后只表达装载的目的基因，不表达任何野生型病毒的基因，自灭活序列修饰使其不能复制，包膜糖蛋白做了pseudotyped 替换为VSV-G。

因此三代包装系统的改造保证了慢病毒载体的生物安全性，目前未有致瘤报道。

4、影响慢病毒产量的因素有哪些？包装过程中，慢病毒的产量随着插入片段的增大而呈指数下降，一般当目的基因＞2k 时即会可见显著的出毒效率降低，当接近4k时，其出毒量会低至可以使用的下限、或几乎不出毒。

插入序列的GC含量＞70%时，产量会受到影响。

一些对包装细胞有毒性的基因，也会导致难以产毒。

5.、慢病毒载体可以容纳多大的插入基因？整个慢病毒基因组在5’和3’LTR之间的最大容纳能力约9k，由于转移载体中各种表达原件的存在，载体的实际装载极限在4k左右。

一般＞3.5k的基因已无法作产量保证。

6、该如何选择转移载体？根据实验应用需求，主要从启动子、荧光/抗性标签等角度选择载体所携带的原件。

慢病毒的病原学及其防治策略研究慢病毒（Slow Virus）是指一类病毒，其复制和感染速度较慢。

慢病毒可以引起较长时间的慢性感染，严重威胁着人类和动物的健康。

慢病毒病的病原学及其防治策略是当前医学和生物学研究的重点之一。

1. 慢病毒的病原学慢病毒主要分为三类：脑炎毒、免疫抑制毒和神经退行性毒。

其中，脑炎毒主要感染中枢神经系统，引起脑炎和脑膜炎等疾病；免疫抑制毒会抑制机体免疫功能，使机体容易感染其他病原体，引发各种慢性疾病；神经退行性毒则会引起神经系统退行性疾病，如痴呆和帕金森等。

慢病毒的病原学主要涉及慢病毒的复制和传播机制。

慢病毒的生命周期非常长，可以在宿主体内长期潜伏。

宿主感染慢病毒后，慢病毒会进入宿主的细胞中，经过一系列的复制和转录，在宿主体内慢慢扩散。

传播方式多种多样，可以通过血液、唾液、粪便等途径传播，也可以通过性传播和垂直传播传染给下一代。

2. 慢病毒的防治策略目前，预防慢病毒感染的最好方法是接种疫苗。

疫苗接种可以刺激机体产生免疫反应，增强机体免疫力，从而有效地预防慢病毒感染。

早期的乙肝疫苗接种就是一个典型的例子。

通过乙肝疫苗接种，全球乙肝病毒感染人数已经大幅度降低，降幅达到了90%以上。

另外，定期对宠物进行疫苗接种也是预防慢病毒感染的重要手段。

此外，强化宣传和教育也是预防慢病毒感染的有效途径。

我们可以通过各种媒体宣传慢病毒的预防知识，让人们了解如何预防慢病毒感染。

此外，定期组织大众参加健康讲座、义诊等活动，提高人们对慢病毒的认识水平和健康意识，积极推广健康生活方式，预防慢病毒感染。

另外，慢病毒的治疗主要是针对症状进行治疗。

因为慢病毒的治疗比较困难，迄今没有有效的特异性治疗方法，主要是对症下药。

例如，治疗免疫抑制毒感染的患者，重点是增强机体免疫力，通过增加细胞因子的产生和提高抗体水平等方法来治疗；而治疗神经退行性毒感染的患者，则主要是采用药物对症处理，缓解症状、延缓病情发展。

3. 思考与展望随着对慢病毒的研究深入，我们发现慢病毒的病原学和防治策略仍然存在很多未知的领域，需要我们继续深入研究。

慢病毒侵染及分子克隆最全知识讲解，学习这一篇就够了！一、慢病毒基础简介二、慢病毒体外包装三、慢病毒体外侵染四、慢病毒滴度测定五、慢病毒体内侵染六、慢病毒质粒构建一、慢病毒基础简介简介：1.慢病毒是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体；2. 逆转录病毒载体；3. 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力；4. 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。

形态结构：侵染过程：二、慢病毒体外包装1.人工体外包装生产慢病毒慢病毒包装的条件：①包装细胞（HEK293T)②辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)③目的慢病毒质粒④转染2. 过表达目的基因的慢病毒包装①试剂：1）包装细胞（HEK293T)2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)3）携带GFP基因CDNA的质粒（Fugw-GFP, Plx304)4）脂质体转染②步骤：1)传代293T细胞；2)24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带表达目的基因的Fugw-GFP质粒，混匀，加入脂质体，吹打混匀；3）静止30min,加入到HEK293T 细胞，等待48 h；4）收集上清即为慢病毒。

3.干扰目的基因表达的慢病毒包装①试剂：1）包装细胞（HEK293T)2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)3）携带干扰目的基因表达的shRNA的质粒（Fugw, PLKO.1)4）脂质体转染②步骤：1）传代293T细胞；2）24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带干扰目的基因表达的质粒PLKO.1 ，混匀，加入脂质体，吹打混匀；3)静止30min,加入到HEK293T 细胞，等待48 h；4）收集上清即为慢病毒。

三、慢病毒体外侵染1.慢病毒体外侵染步骤：①细胞培养箱取出细胞到无菌操作台；②取慢病毒上清直接加入到目的细胞的培养基中，轻轻摇晃；③把细胞放回培养箱，放置2-4 天。

细胞慢病毒感染实验总结
慢病毒源于反转录病毒，但又有所不同。

在感染能力方面比反转录病毒还强，可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、干细胞等多中类型的细胞，又很少引发基因的免疫反应。

实验方法：
在大规模的感染之前，优化以下参数：细胞种植密度，慢病毒的数量，嘌呤霉素的浓度，感染时间，以确定一个实验的最适条件。

在6cm培养皿中种植适当密度的XXX细胞，每孔体积6mL。

贴壁细胞：转染前1天种植XXX细胞。

悬浮细胞：转染当天种植XXX细胞，培养基中需要含有凝聚胺。

XXX细胞中加入病毒：贴壁细胞，弃掉培养基，加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。

或者，弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。

调整体积和凝聚胺的浓度，使得凝聚胺的终浓度为8μg/mL。

病毒感染：孵育细胞过夜。

感染后24h更换培养基。

弃掉培养基，换入6mL新鲜的培养基。

如果需要抗生素选择，则使用含有抗生素的新鲜培养基。

注意：嘌呤霉素的浓度根据每种细胞系来进行优化；常用的浓度范围为2-5μg/mL。

孵育细胞，根据需要每隔几天更换培养基（如果需要，则要含有抗生素）。

孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。

慢病毒使用操作手册一、慢病毒得储存与稀释:1、病毒得储存:收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)①病毒可以存放于-80℃6个月以上;但如果病毒储存时间超过6个月,建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次得使用量进行分装。

2、病毒得稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目得细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。

混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

二、慢病毒用于体外(In Vitro)实验:感染培养原代细胞与建系细胞。

慢病毒对各种细胞与组织得亲嗜性不同,在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您得目得细胞得亲嗜性,感染复数(MOI 值)以及在体(In Vivo)注射所需要得病毒量。

如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适得感染复数(MOI 值)(使用24孔板检测病毒对目得细胞得亲嗜性)。

慢病毒感染目得细胞预实验1、慢病毒感染目得细胞预实验注意事项:①测定慢病毒对目得细胞得亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高得细胞(HEK293T,Hela)作为平行实验得对照细胞。

②在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目得细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其她营养因子得完全培养基不影响慢病毒得感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性得病毒颗粒数。

如:病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性得慢病毒颗粒。

2、以24孔培养板为例,进行目得细胞与HEK293T 细胞得感染预实验实验前按照不同得MOI设置不同得感染孔,并根据MOI与细胞数量计算所需要得病毒量,如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。