7第七章：真核生物的克隆载体
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生物信息学分析方法页数:2
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生物信息学中的基因组测序分析页数:6
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真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
基因工程课后题英文版
第一章为什么基因克隆和DNA 分析很重要genetic engineering: is the direct manipulation of an organism’s genome using modern DNAtechnology. It involves the introduction of foreign DNA or synthetic denes into the organism of interest.1.How to Create a Genetically Modified Plant?Ans:①Create recombinant bacteria with desired gene.②Allow the bacteria to “infect” the plant cells.③Desired gene is interested into plant chromosomes.2.Why gene cloning and PCR are so impartant?Ans: because both techniques can provide a pure sample of an individual gene, separated from all the other genes in the cell.第二章基因克隆的载体：质粒和噬菌体1.Please list essential parts of a cloning vetor .(1) Self-replication: ori site.(2)Plasmid size: as small as possible.(3) Insert site: MCS (Multi-cloning site ).(4)Selectable marker.(5)Not affect host cell.2.Classification of plasmid.1）Based on the main characteristic coded by the plasmid gene.①Fertility or F plasmids②Resistance or R plasmids③Col plasmid④Degradative plasmids⑤virulence plasmids2）depend on whether they carry the tra genes:① conjugative plasmids②non-conjugative plasmids.3）based on the copies they carrying :relaxed plasmids；stringent plasmidsWords：1. Plasmid：A usually circular piece of DNA, primarily independent of the host chromosome, often found in bacteria and some other types of cells.2. cccDNA：(covalently closed-circular DNA): A completely double-standed circular DNA molecule, with no nicks or disconuities, usually with a supercoiled conformation.3. ori（origin of replication: The specific position on a DNA molecule where DNA replication begins.4. episome: A plasmid capable of integration into the host cell's chromosome.5. copy number: The number of molecules of a plasmid contained in a single cell.6. bacteriophage:A virus whose host is a bacterium。
分子生物学检验技术试题及答案
分子生物学检验技术试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 以下哪个不是分子生物学常用的检测技术？A. PCRB. 凝胶电泳C. 免疫组化D. 核酸杂交2. 基因克隆中，常用的载体是：A. 质粒B. 病毒C. 染色体D. 线粒体3. 在分子生物学中，用于扩增DNA片段的技术是：A. 逆转录B. 转录C. 翻译D. PCR4. 以下哪个是真核生物的基因表达调控元件？A. 启动子B. 内含子C. 外显子D. 终止子5. 以下哪个不是DNA测序技术？A. Sanger测序B. 焦磷酸测序C. 凝胶电泳D. 单分子测序二、填空题（每空1分，共10分）6. 核酸分子杂交技术中，常用的标记物有_________、_________等。
7. 基因工程中，用于将目的基因导入受体细胞的方法有_________、_________等。
8. 基因编辑技术CRISPR-Cas9中，Cas9是一种_________。
9. 真核生物的基因表达调控中，mRNA的加工包括5'端加帽、3'端加尾和_________。
10. 蛋白质的分离和纯化技术中，常用的方法有电泳、层析和_________。
三、简答题（每题10分，共20分）11. 简述PCR技术的原理及其在分子生物学中的应用。
12. 描述核酸分子杂交技术的基本原理及其在基因检测中的应用。
四、论述题（每题15分，共30分）13. 论述基因克隆的一般步骤及其在生物技术研究中的重要性。
14. 讨论基因编辑技术CRISPR-Cas9的优势和潜在的伦理问题。
五、实验设计题（每题20分）15. 设计一个实验方案，用于检测某种疾病相关基因的突变情况。
答案：1. C2. A3. D4. A5. C6. 放射性同位素、荧光标记7. 转化、转染8. 核酸酶9. 剪接10. 沉淀11. PCR技术的原理是利用DNA聚合酶在特定温度条件下对目标DNA序列进行循环扩增。
它在分子生物学中的应用包括基因克隆、基因表达分析、遗传病诊断等。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
(生物科技行业)武汉大学微生物教学提纲
第五章微生物的代谢
第一节代谢概论
第二节微生物产能代谢
一、生物氧化
二、异养微生物的生物氧化
1.发酵
2.呼吸作用
(1)有氧呼吸
（2）无氧呼吸
三．自养微生物的生物氧化
1.氨的氧化
2.硫的氧化
3.铁的氧化
4.氢的氧化
四．能量转换
1．底物水平磷酸化
2．氧化磷酸化
3．光合磷酸化
1）环式光合磷酸化
2）非环式光合磷酸化
思考题
试结合一步生长曲线分析病毒的特点，并与细菌进行比较。
第八章微生物遗传
第一节遗传的物质基础
一、DNA作为遗传物质
二、RNA作为遗传物质
三、朊病毒的发现与思考
第二节微生物的基因组结构
一、概念：
二、微生物与人类基因组计划：
三、微生物基因组结构的特点：
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组
第七章病毒
第一节概述
一、病毒的发现和研究历史
二、病毒的特点和定义
1、特点
2、定义
三、病毒的宿主范围
四、病毒的培养和纯化
1、病毒的培养
2．病毒纯化
第二节毒粒的性质
一、毒粒的形态结构
1．病毒的大小和形状
2．毒粒的壳体结构
3．病毒的包膜结构
4．毒粒的结构类型
二、毒粒的化学组成
1．病毒的核酸
2、病毒的蛋白质
四、拮抗
五、竞争
六、捕食
第三节微生物在生态系统中的作用
一、微生物在生态系统中的地位
思考题：
1、试从微生物的特点分析其分布比动植物更广泛的原因，为什么无菌操作技术是一切微生物学工作的基础？
第一节代谢概论
第二节微生物产能代谢
一、生物氧化
二、异养微生物的生物氧化
1.发酵
2.呼吸作用
(1)有氧呼吸
（2）无氧呼吸
三．自养微生物的生物氧化
1.氨的氧化
2.硫的氧化
3.铁的氧化
4.氢的氧化
四．能量转换
1．底物水平磷酸化
2．氧化磷酸化
3．光合磷酸化
1）环式光合磷酸化
2）非环式光合磷酸化
思考题
试结合一步生长曲线分析病毒的特点，并与细菌进行比较。
第八章微生物遗传
第一节遗传的物质基础
一、DNA作为遗传物质
二、RNA作为遗传物质
三、朊病毒的发现与思考
第二节微生物的基因组结构
一、概念：
二、微生物与人类基因组计划：
三、微生物基因组结构的特点：
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组
第七章病毒
第一节概述
一、病毒的发现和研究历史
二、病毒的特点和定义
1、特点
2、定义
三、病毒的宿主范围
四、病毒的培养和纯化
1、病毒的培养
2．病毒纯化
第二节毒粒的性质
一、毒粒的形态结构
1．病毒的大小和形状
2．毒粒的壳体结构
3．病毒的包膜结构
4．毒粒的结构类型
二、毒粒的化学组成
1．病毒的核酸
2、病毒的蛋白质
四、拮抗
五、竞争
六、捕食
第三节微生物在生态系统中的作用
一、微生物在生态系统中的地位
思考题：
1、试从微生物的特点分析其分布比动植物更广泛的原因，为什么无菌操作技术是一切微生物学工作的基础？
基因工程原理(山东联盟)智慧树知到答案章节测试2023年齐鲁工业大学
第一章测试1.1972年，P. Berg领导的研究小组在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。
( )A:对B:错答案:A2.基因工程诞生的意义毫不逊色于有史以来的任何一次技术革命。
( )A:对B:错答案:A3.基因工程受体只能是单个细胞，而不能是组织、器官、更不能是个体。
( )A:错B:对答案:A4.世界上第一例转基因植物是转基因烟草。
( )A:错B:对答案:B5.世界上第一个转基因动物是转基因小鼠。
( )A:对B:错答案:A第二章测试1.最早分离得到的限制性核酸内切酶是( )型限制性核酸内切酶。
A:ⅢB:ⅣC:ⅠD:Ⅱ答案:C2.分离得到的第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶是( )。
A:EcoR IB:BamH ⅠC:Hind ⅡD:Hind Ⅲ答案:C3.进行不完全酶切消化时可采取的方法有( )。
A:增加反应体积B:缩短反应时间C:减少酶的用量D:降低反应温度答案:ABCD4.在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应是利用NAD(或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作能源。
在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP(或腺苷三磷酸)作能源。
A:对B:错答案:A5.选择在12℃~16℃之间用DNA连接酶进行黏性末端连接反应，是为了达到( )之间的平衡。
A:反应速率B:黏性末端的退火C:酶活性D:产物浓度答案:ABC第三章测试1.基因工程中的质粒载体必须包含哪些组成部分( )。
A:选择标记基因B:启动子序列C:酶切插入位点D:复制必需区答案:ACD2.第一个用于基因克隆的天然质粒是( )质粒。
A:pBR322B:pMB1C:pSC101D:pColE1答案:C3.在λ噬菌体裂解周期的早期，环状的λ DNA分子按( )方式进行复制A:γ型双向B:θ型单向C:θ型双向D:γ型单向答案:C4.在λ噬菌体裂解周期的晚期，环状的λ DNA分子按( )方式进行复制。
A:半保留复制B:γ型双向C:滚环D:θ型双向答案:C5.λ噬菌体头部外壳蛋白只能容纳相当于λ噬菌体基因组大小的( )比例的DNA分子。
中国大学MOOC慕课爱课程(7)--第七章课后习题网课刷课
时时刻刻都在
课程答案网课刷课flyingjgh
ATP
有地球生物的能量“通用货币”之称 ATP 就是 .
ADP AMP ATT 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷
一磷酸腺苷
四磷酸腺苷
具有共同起源
生命的本质所表现出化学成分的同一性是地球生命 的一 种表现。
能够适应进化 具有物种不变性
机械论将生命现象简单地归结为物理和化学的过程，即生 命过程的实质就是一架结构极其复杂的机器。这种观 点。
当代生物学以__为带头学科，加上细胞学、神经生物 学及生态学构成四大支柱 在生物体的整个运动过程中，贯穿了物质、__、信息 三者的变化、协调和统一 只有能进行__、自动调节、自我增殖的系统才是有生 命的 生命要与外界环境进行物质和能量的交换，所以它是 个__系统 只有能进行新陈代谢、自我调节、__的系统才是有生 命的
与非生命物质没有本质区别 完全正确 基本完美 尚有可取之处
完全错误
物质
从生物物理学角度的定义，“生命”有三要素， 即 、能 量、信息。
形态 流动
结构
物理学
生命的演化过程总是朝着熵减少的方向进行，一旦负熵的 增加趋近于零，生命将趋向终结，走向死亡。这是从 角 度来理解“生命”的定义。
生物化学 数学
拓扑学
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体细胞杂交(细胞融合技术)使两个不同种类的体细胞融合在一起，从 而产生具有其中一个亲本遗传性状的新细胞。 体细胞杂交(细胞融合技术)的方法有生物学、化学或物理学的。 细胞工程是将一种生物细胞中携带全套遗传信息的基因或染色体全部 转入另一种生物细胞，从而改变细胞的遗传性，改造生物的性状和功 能。 细胞工程中不改变细胞的遗传性。 细胞工程包括细胞融合、细胞器移植、染色体工程、细胞和组培技术 等。 在细胞工程中转移基因是在不同种之间进行的。 将一种生物细胞中携带部分基因或染色体转入另一种生物细胞是细胞 工程。 利用基因工程技术可以将固氮基因转到其他植物中，这样可以免去施 氮肥。 基因工程技术可以应用于疾病诊断。 利用基因工程技术可以生产人胰岛素、生长激素等。 基因工程的目的除了能在受体稳定传代，还要能够表达。 只要目的基因能在受体中复制自己稳定传代，即达到了基因工程的目 的。 免疫学方法筛选带有抗药性基因的质粒用特异性抗体检测基因从而筛 选阳性克隆的方法。 利用核酸杂交法筛选带有抗药性基因的质粒用到的是醋酸纤维薄 膜。 利用核酸杂交法筛选带有抗药性基因的质粒，需要用到放射自显影技 术。 遗传学方法筛选对于带有抗药性基因的质粒，可通过检测受体菌是否 由抗药状态变成敏感状态进行筛选。 筛选就是从大量携带重组体 DNA 的宿主细胞中分离出携带目的基因 的细胞。 转染完整病毒感染细胞或原生质体的过程。 转导用细菌做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程。 转染是某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的 DNA， 而使其基因型和表型发生相应变化的现象。 转导是某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的 DNA， 而使其基因型和表型发生相应变化的现象。 转化是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。 转化是除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。 转染是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。 转导是除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。 转导是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。
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有地球生物的能量“通用货币”之称 ATP 就是 .
ADP AMP ATT 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷
一磷酸腺苷
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具有共同起源
生命的本质所表现出化学成分的同一性是地球生命 的一 种表现。
能够适应进化 具有物种不变性
机械论将生命现象简单地归结为物理和化学的过程，即生 命过程的实质就是一架结构极其复杂的机器。这种观 点。
当代生物学以__为带头学科，加上细胞学、神经生物 学及生态学构成四大支柱 在生物体的整个运动过程中，贯穿了物质、__、信息 三者的变化、协调和统一 只有能进行__、自动调节、自我增殖的系统才是有生 命的 生命要与外界环境进行物质和能量的交换，所以它是 个__系统 只有能进行新陈代谢、自我调节、__的系统才是有生 命的
与非生命物质没有本质区别 完全正确 基本完美 尚有可取之处
完全错误
物质
从生物物理学角度的定义，“生命”有三要素， 即 、能 量、信息。
形态 流动
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物理学
生命的演化过程总是朝着熵减少的方向进行，一旦负熵的 增加趋近于零，生命将趋向终结，走向死亡。这是从 角 度来理解“生命”的定义。
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体细胞杂交(细胞融合技术)使两个不同种类的体细胞融合在一起，从 而产生具有其中一个亲本遗传性状的新细胞。 体细胞杂交(细胞融合技术)的方法有生物学、化学或物理学的。 细胞工程是将一种生物细胞中携带全套遗传信息的基因或染色体全部 转入另一种生物细胞，从而改变细胞的遗传性，改造生物的性状和功 能。 细胞工程中不改变细胞的遗传性。 细胞工程包括细胞融合、细胞器移植、染色体工程、细胞和组培技术 等。 在细胞工程中转移基因是在不同种之间进行的。 将一种生物细胞中携带部分基因或染色体转入另一种生物细胞是细胞 工程。 利用基因工程技术可以将固氮基因转到其他植物中，这样可以免去施 氮肥。 基因工程技术可以应用于疾病诊断。 利用基因工程技术可以生产人胰岛素、生长激素等。 基因工程的目的除了能在受体稳定传代，还要能够表达。 只要目的基因能在受体中复制自己稳定传代，即达到了基因工程的目 的。 免疫学方法筛选带有抗药性基因的质粒用特异性抗体检测基因从而筛 选阳性克隆的方法。 利用核酸杂交法筛选带有抗药性基因的质粒用到的是醋酸纤维薄 膜。 利用核酸杂交法筛选带有抗药性基因的质粒，需要用到放射自显影技 术。 遗传学方法筛选对于带有抗药性基因的质粒，可通过检测受体菌是否 由抗药状态变成敏感状态进行筛选。 筛选就是从大量携带重组体 DNA 的宿主细胞中分离出携带目的基因 的细胞。 转染完整病毒感染细胞或原生质体的过程。 转导用细菌做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程。 转染是某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的 DNA， 而使其基因型和表型发生相应变化的现象。 转导是某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的 DNA， 而使其基因型和表型发生相应变化的现象。 转化是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。 转化是除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。 转染是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。 转导是除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。 转导是用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过 程。
7第七章：真核生物的克隆载体
TRP1和复制起点。
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
(完整版)微生物学教学大纲
课程编号：《微生物学》授课大纲学时数： 72讲课：72学制：四年制本科适合专业：生物科学有关专业一、本课程的性质和任务（一）课程的性质微生物学是生命科学中一门理论与实践性较强的重要基础课程，是一门对现代生命科学的发展发挥着不可以取代的重要作用的学科，故本课程分为理论解说和实践授课两大部分（实验部分还有授课大纲）。
理论课授课主要解说微生物发展的历史、微生物的形态构造、营养和代谢特点、遗传规律、生态、传染与免疫和系统分类等内容。
（二）课程的任务：本课程主要面对生物科学专业的本科学生讲课，是专业必修课。
经过学习微生物的形态构造、生理生化、生长生殖、遗传变异、生态分布、传染免疫、分类判断以及微生物与其他生物的互有关系及其多样性，在工、农、医等方面的应用，认识该学科的发展前沿、热点和问题，使学生牢固掌握微生物学的基本理论和基础知识，认识微生物的基本特点及其生命活动规律，为学生今后的学习及工作实践打下宽厚的基础。
二、本课程与其他课程的联系：微生物学是一门专业基础课，与好多课程关系亲近，应在生物化学、遗传学、生理学等课程的基础进步行学习，并为今后专业课，如遗传学、生物化学等课程的学习确定基础。
三、授课内容（一）第一章绪论一、本学期的授课安排二、微生物和你三、微生物学四、微生物的发现和微生物学的发展五、 20 世纪的微生物学六、 21 世纪微生物学发展的特点和趋势授课基本要求：学习微生物学这门课程，必定第一认识什么是微生物、主要种类、特点、发展情况、研究意义等等。
本章要修业生在联系本质的情况下掌握微生物的见解、特点，并提起学生学习微生物的兴趣。
主要知识点与重点：微生物的见解、类群及特点。
（二）第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分别和纯培养一、无菌技术二、用固体培养基获得纯培养三、用液体培养基获得纯培养四、单细胞（孢子）分别五、选择培养分别六、微生物的珍藏技术第二节显微镜和显微技术一、显微镜的种类及原理二、显微观察样品的制备第三节显微镜下的微生物一、细菌和古菌二、真菌三、藻类四、原生动物授课基本要求：掌握微生物学研究的基本技术，即无菌技术、纯种分别技术、培养技术及显微镜技术。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
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2μm质粒是非常好的克隆载体： A、它6kb（6318bp），大小合适， B、在酵母细胞中有相当高的拷贝数，70-200， C、利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由 寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1, REP2。 2μm 质粒的问题：选择标记的问题。
• 实际上，经常使用一个普通的酵母基因，一般是一个
7.1.6
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学 研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌 基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒 和自主复制型质粒两大类。 在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
受体酵母是利用一个双营养缺陷体trp1- ,ura3-，载体上含有互补
只有含有结构正确的人工染色体的转化体细胞可以正常生长。含
基因(trp1+ ,ura3+ ）作为选择标记。转化后于基本培养基上培养，
有两个左臂或者两个右臂的染色体都不能正常生长，因为其中一
个选择标记基因丢失，转化体不能在基本培养基上存活。外源
高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程 高等植物转基因技术 转基因植株
高等植物细胞基因表达技 术
植物工程细胞 蛋白多肽物质大规模生产 小分子化合物大规模生产
农作物遗传性状改良
7.2.1
7.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统
• 人们在高等植物中从来没找到自然产生的质粒，但发现了一种 非常重要的细菌质粒，即根瘤（癌）农杆菌中的Ti质粒。 • 革兰氏阴性土壤杆菌根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）能 特异性感染几乎所有双子叶植物的根部，形成根瘤（冠瘿）， 并干扰受感染植物的正常生长。这种致瘤特性与细菌体内存在 的野生型Ti（Tumor inducing）质粒的传递、整合及相关基因 的表达密切相关。 • 野生型Ti质粒是一个相当大的质粒，大小约200-800kb，其中 与植物感染和致瘤有关的T-DNA区和vir区分别为12-24kb和 35kb。T-DNA上含有三套8个基因可以在植物细胞内表达，并 引起转化细胞的癌变。 • Ti质粒根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ同， 可以被分成4种类型：章鱼碱型（octopine）、胭脂碱型 （nopaline）、农杆碱型（agropine)和农杆菌素碱型 （agrocinopine）。
DNA片段是否插入的鉴定，可以通过SUP4基因的插入失活判断，
白色的克隆是重组子，红色的不是。
YAC 载体 和用 它克 隆大 片段 DNA 的方 法
与平末端的插入DNA连接
插入的DNA
YAC载体的应用
• （1）大片段DNA的克隆：一些哺乳动物的基因大于100kb （如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系 统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。 • （2）基因功能和表达分析：最近的研究发现，在某些情况 下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在某个基因本 来存在的生物体内克隆600kb的片段,一些特殊的类型可以大容量的YAC载体会产生插入稳定性的问题，插入的 DNA有时会发生分子内重组而重排。
7.1 酵母和其他真菌的载体
酵母是生物技术中最重要的生物体之一，除了酿酒和
生产面包外，酵母也被用来作为基因克隆的受体生产
多种重要的药物。
在大多数酿酒酵母菌株中发现了一种2μm质粒，是真
核生物细胞中找到的为数不多的几个质粒之一，这个
发现极大地刺激了酵母的克隆载体的发展。
7.1.1
7.1.1 2μ m质粒的筛选标记
7.1.5 可以用酵母人工染色体克隆大片段DNA
酵母克隆载体的最后一种类型是酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) 。 染色体的主要组成如下：
1) 着丝粒：cell分裂时需要借助它把染色体正确地分配
到子代细胞中去。 2) 两个端粒：存在于染色体的末端，使染色体正确的结
林木等，甚至改变遗传的物质基础——如治疗人类遗传病或延缓 衰老等，这时，克隆载体不仅局限于E.coli，而要用到以酵母、 动植物等其他真核生物为受体（宿主）的克隆载体。 下面我们分别学习酵母和真菌、高等植物和动物的克隆载体。
7.1 酵母和其他真菌的载体 7.1.1 2μm质粒的筛选标记 7.1.2 基于2μm质粒的载体—— 酵母游离型质粒（yeast episomal plasmids,YEps) 7.1.3 YEps可以插入酵母的染色体DNA 7.1.4 其他类型的酵母克隆载体 7.1.5 可以用酵母人工染色体克隆大片段DNA 7.1.6 其他酵母和真菌的载体 7.2 高等植物的克隆载体 7.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统 7.2.2 植物细胞的直接转化程序 7.2.3 植物病毒介导的转染程序 7.3 动物的克隆载体 7.3.1 昆虫的克隆载体 7.3.2 在哺乳动物中克隆基因
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
YAC载体的结构和用途
• YAC载体有好几种，以pYAC3为典型例子说明其结构和用途 [图7-8（a）]。 • pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中 两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记分别存在于 YIp5和YRp7，就像在YRp7中一样，携带TRP1的同时也包 含一个复制起点，但在pYAC3中这一片段扩展到CEN4，它 是一段来自4号染色体着丝粒的DNA片段。TRP1-originCEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。 • 第三部分端粒，由两段称为TEL的序列提供，并不是他们自 身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列 建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，它在克隆 实验中作为插入片段的选择标记基因。
利用pYAC3克隆的策略
载体用BamHI和SnaBI双酶切，切成3个片段，移去BamHI位 点之间的片段，剩下两个臂，每一臂都是TEL作为一个末端，另 一末端是SnaBI位点。被克隆的DNA必须切成平端（因SnaBI是 一个平端内切酶，识别序列是TACGTA），把三者连接在一起就
产生了人工染色体。利用原生质体转化法将人工染色体引入酵母。
• 2、拷贝数：YEp和YRp有较高的拷贝数（分别是：2050和5-100），而YIp在每个细胞中只存一份拷贝。 要获得克隆基因编码的蛋白质时，拷贝数越多越好。 • 3、重组体的稳定性：YIp可以产生非常稳定的重组体， 如果克隆实验要求酵母重组体细胞必须长时间保存克隆 的基因，YIp是最佳选择。
7.1.5
pBR322的完整序列。因此，它可以在酵母和大肠杆菌
这两种宿主细胞内进行复制和筛选。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。 • 在酵母中进行克隆实验的标准步骤：首先要在大肠 杆菌中进行克隆试验，选择重组子，重组质粒纯化 后再转化酵母。
7.1.3
7.1.3 YEps可以插入酵母的染色体DNA
“游离型”(附加体)就意味着YEp可以像质粒一样
独立的复制，也可以整合到酵母的染色体内。因为 在载体中作为选择标记的正常基因与酵母染色体上 的突变基因同源性很高，比如YEp13质粒中LEU2基 因可以与染色体上突变的LEU2-基因进行重组，将整
与氨基酸合成有关的酶，如LEU2基因，编码β-异丙 基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。 • 用LEU2基因作筛选标记，对寄主生物有特殊的要求， 寄主必须是一个营养缺陷型（auxotrophic）突变体， 含有一个无功能的LEU2基因。这样的寄主只有在添 加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU2合成 基因，可以在基本培养基上生长。只有成功转化了 2μm质粒的细胞能够存活，形成菌落。
束复制，防止染色体被外切酶撕咬。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位臵。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染
色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一
起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状
态，也可能再经过一次重组而被切割下来。
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母 C.S DNA。重组后会有LEU2基因的两个拷贝；通常有一个 7.1.4 是有功能的，而另一个是沉默的
7.1.4 其他类型的酵母克隆载体
• （1）酵母整合型质粒（yeast integrative plasmids,YIps）： 主要是细菌质粒含有一个酵母基因。如YIp5，是在pBR322 的基础上插入了一个酵母基因URA3，编码乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，URA3可以作为选择 标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不包含2µm质粒的 任何部分，不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母 的染色体上，整合的机制与YEp相同。 • （2）酵母复制型质粒（yeast replicative plasmids,YRps）： 由于含有一段包括复制起点在内的酵母染色体DNA，可以 作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离 很近，包括作为选择标记的基因。如YRp7，它是在 pBR322质粒中加上酵母基因TRP1，TRP1参与色氨酸的合 成，它紧挨着复制起点。插入YRp7的酵母DNA片段包括 TRP1和复制起点。
• 实际上，经常使用一个普通的酵母基因，一般是一个
7.1.6
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学 研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌 基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒 和自主复制型质粒两大类。 在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
受体酵母是利用一个双营养缺陷体trp1- ,ura3-，载体上含有互补
只有含有结构正确的人工染色体的转化体细胞可以正常生长。含
基因(trp1+ ,ura3+ ）作为选择标记。转化后于基本培养基上培养，
有两个左臂或者两个右臂的染色体都不能正常生长，因为其中一
个选择标记基因丢失，转化体不能在基本培养基上存活。外源
高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程 高等植物转基因技术 转基因植株
高等植物细胞基因表达技 术
植物工程细胞 蛋白多肽物质大规模生产 小分子化合物大规模生产
农作物遗传性状改良
7.2.1
7.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统
• 人们在高等植物中从来没找到自然产生的质粒，但发现了一种 非常重要的细菌质粒，即根瘤（癌）农杆菌中的Ti质粒。 • 革兰氏阴性土壤杆菌根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）能 特异性感染几乎所有双子叶植物的根部，形成根瘤（冠瘿）， 并干扰受感染植物的正常生长。这种致瘤特性与细菌体内存在 的野生型Ti（Tumor inducing）质粒的传递、整合及相关基因 的表达密切相关。 • 野生型Ti质粒是一个相当大的质粒，大小约200-800kb，其中 与植物感染和致瘤有关的T-DNA区和vir区分别为12-24kb和 35kb。T-DNA上含有三套8个基因可以在植物细胞内表达，并 引起转化细胞的癌变。 • Ti质粒根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ同， 可以被分成4种类型：章鱼碱型（octopine）、胭脂碱型 （nopaline）、农杆碱型（agropine)和农杆菌素碱型 （agrocinopine）。
DNA片段是否插入的鉴定，可以通过SUP4基因的插入失活判断，
白色的克隆是重组子，红色的不是。
YAC 载体 和用 它克 隆大 片段 DNA 的方 法
与平末端的插入DNA连接
插入的DNA
YAC载体的应用
• （1）大片段DNA的克隆：一些哺乳动物的基因大于100kb （如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系 统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。 • （2）基因功能和表达分析：最近的研究发现，在某些情况 下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在某个基因本 来存在的生物体内克隆600kb的片段,一些特殊的类型可以大容量的YAC载体会产生插入稳定性的问题，插入的 DNA有时会发生分子内重组而重排。
7.1 酵母和其他真菌的载体
酵母是生物技术中最重要的生物体之一，除了酿酒和
生产面包外，酵母也被用来作为基因克隆的受体生产
多种重要的药物。
在大多数酿酒酵母菌株中发现了一种2μm质粒，是真
核生物细胞中找到的为数不多的几个质粒之一，这个
发现极大地刺激了酵母的克隆载体的发展。
7.1.1
7.1.1 2μ m质粒的筛选标记
7.1.5 可以用酵母人工染色体克隆大片段DNA
酵母克隆载体的最后一种类型是酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) 。 染色体的主要组成如下：
1) 着丝粒：cell分裂时需要借助它把染色体正确地分配
到子代细胞中去。 2) 两个端粒：存在于染色体的末端，使染色体正确的结
林木等，甚至改变遗传的物质基础——如治疗人类遗传病或延缓 衰老等，这时，克隆载体不仅局限于E.coli，而要用到以酵母、 动植物等其他真核生物为受体（宿主）的克隆载体。 下面我们分别学习酵母和真菌、高等植物和动物的克隆载体。
7.1 酵母和其他真菌的载体 7.1.1 2μm质粒的筛选标记 7.1.2 基于2μm质粒的载体—— 酵母游离型质粒（yeast episomal plasmids,YEps) 7.1.3 YEps可以插入酵母的染色体DNA 7.1.4 其他类型的酵母克隆载体 7.1.5 可以用酵母人工染色体克隆大片段DNA 7.1.6 其他酵母和真菌的载体 7.2 高等植物的克隆载体 7.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统 7.2.2 植物细胞的直接转化程序 7.2.3 植物病毒介导的转染程序 7.3 动物的克隆载体 7.3.1 昆虫的克隆载体 7.3.2 在哺乳动物中克隆基因
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
YAC载体的结构和用途
• YAC载体有好几种，以pYAC3为典型例子说明其结构和用途 [图7-8（a）]。 • pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中 两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记分别存在于 YIp5和YRp7，就像在YRp7中一样，携带TRP1的同时也包 含一个复制起点，但在pYAC3中这一片段扩展到CEN4，它 是一段来自4号染色体着丝粒的DNA片段。TRP1-originCEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。 • 第三部分端粒，由两段称为TEL的序列提供，并不是他们自 身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列 建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，它在克隆 实验中作为插入片段的选择标记基因。
利用pYAC3克隆的策略
载体用BamHI和SnaBI双酶切，切成3个片段，移去BamHI位 点之间的片段，剩下两个臂，每一臂都是TEL作为一个末端，另 一末端是SnaBI位点。被克隆的DNA必须切成平端（因SnaBI是 一个平端内切酶，识别序列是TACGTA），把三者连接在一起就
产生了人工染色体。利用原生质体转化法将人工染色体引入酵母。
• 2、拷贝数：YEp和YRp有较高的拷贝数（分别是：2050和5-100），而YIp在每个细胞中只存一份拷贝。 要获得克隆基因编码的蛋白质时，拷贝数越多越好。 • 3、重组体的稳定性：YIp可以产生非常稳定的重组体， 如果克隆实验要求酵母重组体细胞必须长时间保存克隆 的基因，YIp是最佳选择。
7.1.5
pBR322的完整序列。因此，它可以在酵母和大肠杆菌
这两种宿主细胞内进行复制和筛选。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。 • 在酵母中进行克隆实验的标准步骤：首先要在大肠 杆菌中进行克隆试验，选择重组子，重组质粒纯化 后再转化酵母。
7.1.3
7.1.3 YEps可以插入酵母的染色体DNA
“游离型”(附加体)就意味着YEp可以像质粒一样
独立的复制，也可以整合到酵母的染色体内。因为 在载体中作为选择标记的正常基因与酵母染色体上 的突变基因同源性很高，比如YEp13质粒中LEU2基 因可以与染色体上突变的LEU2-基因进行重组，将整
与氨基酸合成有关的酶，如LEU2基因，编码β-异丙 基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。 • 用LEU2基因作筛选标记，对寄主生物有特殊的要求， 寄主必须是一个营养缺陷型（auxotrophic）突变体， 含有一个无功能的LEU2基因。这样的寄主只有在添 加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU2合成 基因，可以在基本培养基上生长。只有成功转化了 2μm质粒的细胞能够存活，形成菌落。
束复制，防止染色体被外切酶撕咬。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位臵。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染
色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一
起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状
态，也可能再经过一次重组而被切割下来。
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母 C.S DNA。重组后会有LEU2基因的两个拷贝；通常有一个 7.1.4 是有功能的，而另一个是沉默的
7.1.4 其他类型的酵母克隆载体
• （1）酵母整合型质粒（yeast integrative plasmids,YIps）： 主要是细菌质粒含有一个酵母基因。如YIp5，是在pBR322 的基础上插入了一个酵母基因URA3，编码乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，URA3可以作为选择 标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不包含2µm质粒的 任何部分，不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母 的染色体上，整合的机制与YEp相同。 • （2）酵母复制型质粒（yeast replicative plasmids,YRps）： 由于含有一段包括复制起点在内的酵母染色体DNA，可以 作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离 很近，包括作为选择标记的基因。如YRp7，它是在 pBR322质粒中加上酵母基因TRP1，TRP1参与色氨酸的合 成，它紧挨着复制起点。插入YRp7的酵母DNA片段包括 TRP1和复制起点。