免疫细胞化学技术

免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。

免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。

标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。

2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。

标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。

蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。

冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。

抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。

常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。

2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。

3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。

免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。

它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。

60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。

——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。

——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。

——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。

——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。

其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。

2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。

（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。

（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。

3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。

（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。

其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。

1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。

六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。

分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。

关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。

2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。

4℃PBS，洗5min×3次。

吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。

这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。

3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。

固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。

(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。

PBS洗5min×3次。

(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。

PBS洗5min×3次。

细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。

(4)BSA封闭，室温10min。

倾去，勿洗。

(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。

PBS洗5min×3次。

抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。

(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。

PBS洗5min×3次。

(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。

蒸馏水充分冲洗。

(8)苏木素染2min。

自来水充分冲洗。

(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。

封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。

后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。

而且二甲苯太呛人了。

(10)中性树胶封片。

免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术是一种用于研究细胞中蛋白质和其他分子的方法，它是由多种技术组合而成，包括免疫染色，蛋白质印迹，荧光免疫染色，荧光激活细胞排序，流式细胞术等。

它可以用来研究细胞中的蛋白质组成，结构，功能，信号转导和其他活动。

免疫细胞化学技术的主要步骤是：第一步，从细胞中提取蛋白质；第二步，用特异性抗体进行免疫染色；第三步，检测染色的蛋白质组成；第四步，用荧光技术进行检测和定量分析。

免疫细胞化学技术的优点是可以快速、准确、灵敏地检测细胞中蛋白质的分布和组成，可以用来对细胞中蛋白质的结构，功能，信号转导，代谢和其他活动进行详细的研究。

它还可以用来鉴定和确认细胞内的病毒，细胞外的病原体，细胞表面的抗原，细胞内的酶和其他分子。

免疫细胞化学技术已经在生物医学研究中应用广泛，用于研究疾病的发病机制，诊断疾病，发现新药物，评价治疗效果等。

它在肿瘤学，神经病学，免疫学，病毒学，心血管病学，营养学，遗传学等领域发挥了重要作用。

总之，免疫细胞化学技术是一种重要的研究细胞中蛋白质组成，结构，功能，信号转导和其他活动的研究方法，具有快速，准确，灵
敏，定量，多种技术组合等优点，已经在疾病的研究，诊断，治疗，药物发现等多个领域得到广泛应用。

电子显微镜免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学分辨率的限制，不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。

因此，Singer 于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白（ferritin ）标记抗体的方法，为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。

在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。

电子显微镜免疫细胞化学技术（以下简称免疫电镜技术技术）区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：一、组织固定与取材在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。

因此，选用固定剂不宜过强。

常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde 简称PLP 液）。

也有采用Bouin 氏液、Zamboni 氏液或4%多聚甲醛液（其配制法见附录）。

国外不少文献推荐应用PLP 液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择性地使糖类固定，就可使抗原性稳定。

PLP 液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。

但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。

在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

二、免疫染色分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。

如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层thermanox 塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。

免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。

）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。

）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。

）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。

）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。

（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。

）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。

（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。

）8.用TBST洗2次，5min/次。

（如抗体的非特异多也可多洗。

）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。

10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。

（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。

细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。

细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。

细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。

骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。

以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。

（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。

（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。

“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。

第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。

减少对组织标本的损伤与挤压。

2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。

（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。

标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。

2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。

组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。

3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

首选冷冻切片。

其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。

免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。

–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。

–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

抗原(antigen, Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。

抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。

·免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。

例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。

·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。