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大豆GmGBP1基因启动子的光周期响应元件TCT-motif功能分析李英华;赵琳;王阔;郑艳红;李敏敏;许崇晶;杨雪;王春生;张妍;李文滨【摘要】GmGBP1基因启动子的多态性位点SNP-796与生育期密切相关,SNP-796G为缩短大豆生育期的优异等位基因.本研究运用生物信息学手段分析发现,等位基因SNP-796 G→A变异会导致TCT-motif光效应元件的变异.将包括SNP-796位点的GmGBP1基因的启动子片段与双萤光素酶(luciferase)报告基因融合构建植物表达载体并转化烟草,结合烟草叶片中的农杆菌瞬时表达试验,分析了该启动子中TCT-motif顺式作用元件的功能.结果显示,TCT-motif受短日照条件诱导,引起Luciferase基因显著上调表达.在短日照条件下,TCT-motif可能通过增加GmGBP1基因mRNA的表达量,从而缩短大豆品种的生育期.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2018(040)004【总页数】5页(P592-596)【关键词】大豆;GmGBP1基因启动子;光周期;TCT-motif【作者】李英华;赵琳;王阔;郑艳红;李敏敏;许崇晶;杨雪;王春生;张妍;李文滨【作者单位】东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S565.103AtSKIP基因通过调节昼夜节律钟影响拟南芥的花期[1]。
大豆基因组结构和功能分析在当今科技飞速发展的时代，基因组学已成为生物科学研究的一项关键技术。
在这个领域里，大豆基因组被广泛地研究，旨在深入了解其结构与功能。
本文将以大豆基因组为例，探讨其结构和功能的分析。
一、基因组结构分析大豆基因组的大小约为1.1 Gb，在染色体中具有20个编号，其中16个种类61个染色体来自同源染色体重组后的基因组主体，另外4个染色体采用单倍型大豆用于组装所有剩余染色体序列。
大豆基因组的大小比人类和小鼠基因组都小，但其拥有的基因数是两者的两倍。
这些基因都编码着生物体的生命活动所必需的不同蛋白质。
为了更好地了解这些基因，需要对它们的结构有一定的了解。
1. 基因分布大豆基因组具有高密度的基因分布，大部分基因（约75％）集中在染色体上，其中七号染色体上的基因数密度最高。
其余基因主要分布在长串连的基因或大量的单独基因中。
因此，大豆的基因分布相当分散，而且基因间的距离差异很大。
这种基因分布结构有助于增加大豆种群的遗传多样性和对环境的适应性。
2. 基因结构大豆基因的结构主要由起始密码子、终止密码子、内含子和外显子组成。
它们的顺序和位置是确定基因间距、编码区域和非编码区域的关键因素。
基因的内含子和外显子之间存在许多不同长度的序列，以调节基因表达和注意其特定的功能。
这些序列涉及不同的转录调控元件，包括启动子、增强子、转录抑制子和小核RNA 等。
3. 基因家族大豆还拥有众多的基因家族，如转录因子家族、结构蛋白质家族、激酶和磷酸酯酶家族等。
它们分别在不同的代谢途径和生物学特征中具有不同的作用，因此这些基因家族对于大豆生长和发育具有重要的意义。
二、基因组功能分析大豆基因组在基因结构分析的基础上，进一步通过功能分析来揭示基因的生物学作用和功能机制，探索它们在代谢途径、信号传导和反应等各方面的作用。
1. 代谢途径大豆基因组分析揭示了大豆的代谢途径，如脂肪酸代谢、碳水化合物代谢、氮代谢、植酸代谢等。
这些途径涉及转录因子、代谢基因和氧化还原酶等。
大豆基因的克隆及表达载体的构成大豆（Glycine max）是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子中含有高蛋白、高油、高碳水化合物等营养成分，因此在全球范围内广泛种植和应用。
为了深入研究大豆的生长发育、代谢调控等基本生物学问题，以及开发新的大豆品种，需要对大豆基因进行克隆和表达研究。
下面我们来介绍大豆基因的克隆及表达载体的构成。
一、大豆基因的克隆大豆基因的克隆是指从大豆中分离出目标基因的过程。
大豆基因的克隆方法主要有PCR扩增、基因文库筛选和基因芯片等。
其中，PCR扩增是最常用的方法之一。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶链反应（PCR）技术，通过引物特异性扩增目标基因序列。
PCR扩增方法具有快速、简便、高效、灵敏等优点，适用于小片段基因的克隆。
而对于大片段基因的克隆，则需要使用基因文库筛选和基因芯片等方法。
二、大豆基因的表达载体的构成大豆基因的表达载体是指将目标基因插入到表达载体中，通过转化到宿主细胞中，使目标基因得以表达的载体。
大豆基因的表达载体构成主要包括以下几个部分：1.启动子：启动子是指调控基因转录的DNA序列，它位于基因的上游区域，与转录因子结合后启动基因的转录。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的启动子包括CaMV 35S启动子、nos启动子、ubi启动子等。
2.选择性标记基因：选择性标记基因是指在转化过程中，通过对宿主细胞进行筛选，选择带有表达载体的细胞的基因。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的选择性标记基因包括抗生素耐药基因、草酸乙酯酯化酶基因等。
3.多克隆位点：多克隆位点是指在表达载体中设置多个限制性内切酶切割位点，方便将目标基因插入到载体中。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的多克隆位点包括pUC19多克隆位点、pGEM-T多克隆位点等。
4.表达标签：表达标签是指将目标基因与特定的标签融合，以便于检测目标基因的表达情况。
在大豆基因表达载体的构建中，常使用的表达标签包括His标签、GST标签、FLAG标签等。
![豆荚特异性启动子GmPLC12[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/7290531759fb770bf78a6529647d27284a733743.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510206458.7(22)申请日 2015.04.28C12N 15/113(2010.01)C12N 15/10(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2006.01)(71)申请人吉林农业大学地址130118 吉林省长春市净月开发区新城大街2888号(72)发明人王法微 李海燕 邓宇 王南李晓薇 董园园 陈欢 董金晔(74)专利代理机构长春市东师专利事务所22202代理人张铁生(54)发明名称豆荚特异性启动子GmPLC12(57)摘要本发明公开了大豆豆荚特异性启动子GmPLC12来源于威廉姆斯82，其核苷酸序列见SEQID No.1。
它是以威廉姆斯82基因组DNA 为模板，通过PCR 方法获得中间片段后，在大豆基因组中map 到该基因启动子区域，从而获得GmPLC12基因启动子的全长核苷酸序列。
GmPLC12基因启动子在早期豆荚中特异表达，而在其他部位表达较低。
证明GmPLC12基因启动子具有豆荚表达的特异性；为豆荚专一性遗传信息改造提供优质的启动元件。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图2页(10)申请公布号CN 104789567 A (43)申请公布日2015.07.22C N 104789567A1.豆荚特异性启动子GmPLC12，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.豆荚特异性启动子GmPLC12的制备方法，它是以大豆品种威廉姆斯82基因组DNA为模板，用引物F：GCCTGCTAAAAATATATTTG与R：TCATGGAGACCTCAATATAA扩增，获得。
3.一种表达载体，它是在表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的启动子。
4.豆荚特异性启动子GmPLC12在培育转基因植物的应用。
大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析赵艳;孙天国;王慧;张梅娟;崔巍;沙伟【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)012【摘要】【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因（soyAP1）启动子,并对其表达方式及活性进行分析。
【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。
利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。
通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。
【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。
【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。
【总页数】6页(P79-84)【作者】赵艳;孙天国;王慧;张梅娟;崔巍;沙伟【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】S565.103.53【相关文献】1.华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析 [J], 赵俊红;胡旭初;徐劲;胡凤玉;周红娟;胡慧霞;郑小凌;李艳文;余新炳2.小鼠超高硫角蛋白基因启动子的克隆及其表达活性分析 [J], 李昊;王春生;宁方勇;梁洋;朴善花;安铁洙3.猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析 [J], 顾克翠;王欢欢;谢周瑞;徐银学;陈杰4.大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 [J], 张庆林 ;赵艳;李晓薇 ;翟莹 ;张艳 ;王英 ;李景文;王庆钰5.白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析 [J], 李蕾蕾;孙丰坤;李天宇;寇萍;詹亚光;曾凡锁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物组织特异性启动子的研究进展摘要：组织特异性启动子也称器官特异性启动子(organ specific promoter)，可调控基因只在某些特定的部位或器官中表达，并往往表现出发育调节的特性。
本文介绍了植物组织特异性启动子中的花、果实、种子及叶特异性启动子，并对植物组织特异性启动子研究中问题进行了讨论和展望。
关键词：植物组织特异性启动子，研究进展启动子(promoter)是RNA聚合酶能够识别并与之结合从而起始基因转录的DNA序列，是重要的顺式作用元件，位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。
目前，植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子(Constitutive promoter)。
组织特异性启动子也称器官特异性启动子(organ specific promoter)，可调控基因只在某些特定的部位或器官中表达，并往往表现出发育调节的特性。
外源基因在细胞中表达是基因工程研究的关键，而组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。
因此，组织特异性启动子一直都是植物基因工程中研究的重点和难点，研究者在植物的分生组织、维管束组织、薄壁组织、花粉、种子和胚乳等几乎各种组织中都发现有组织特异性驱动基因表达的启动子[1]，尤其在根、维管束和韧皮部特异表达启动子研究中取得了很大进展。
1 植物生殖器官表达的组织特异性启动子1.1 花特异启动子高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程，它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化，同时伴随大量基因的协同表达。
植物花特异表达启动子只在植物开花的时期启动基因的表达，它的分离克隆为花卉的品质改良提供了重要的顺式调控元件。
人们克隆了许多花药特异表达的基因，如在花药绒毡层特异表达的TA29[2]和A9[3]以及在花粉壁特异表达的Bp4A[4]基因等，这些基因都是在花药营养细胞中表达，与生殖细胞的分化无关。
两种植物组织特异性基因表达方法分析目前研究人员已经在不同植物中分离并证实了多种具有组织表达特异性的启动子，以下是搜集整理的一篇相关，欢迎阅读参考。
ﻭ多细胞生物体内存在不同类型的器、组织、细胞，它们有各自的特性，担负着不同的功能。
例如,植物根表皮中的根毛细胞，主要负责从周围土壤中吸收水分与矿质营养。
与这一功能相适应，它们在发育过程中向外突起管状结构以增加其表面积和吸收水分、养分的能力（Ｇrｉer-sｏｎ和Schiefelｂein2002);植物根里的内皮层细胞在发育过程中通过特殊的细胞壁加厚和特定部位胼胝质的沉积凯氏带，阻止矿质养分向维管束和地上部分渗透，控制皮层和维管柱之间的物质运输；在茎和叶片中，保卫细胞可以调节内部叶肉细胞与外部环境之间的气体交换，这一过程需要依赖周围细胞通过K离子交换来创造一个调节气孔关闭与打开的膨压（Raｓchke和Feｌlｏws１971）。
这些不同类型器、组织、细胞的，以及它们之间功能的差异,在很大程度上取决于特异性表达的基因。
因此,研究不同器、组织、细胞中呈特异性表达的基因，对了解植物生长发育调控机理，细胞类型与功能之间的关系都有重要意义。
此外，研究组织特异性表达的基因的调控机理，可帮助我们构建植物组织特异性表达体系,有目的地在特定器、组织、细胞中表达特定靶基因，以便进行靶基因功能分析。
组织特异性表达技术在植物基因工程中具有一定的应用前景，如利用植物的特定组织细胞合成所需要的代谢产物，还可以用于作物改良的基因工程等.组织特异性表达技术是近年来植物学研究中的一个重要领域(Uｂeda－Tomａs等２00８;Pleｔt等2０10；Duan等2０13）。
ﻭ本文主要介绍目前被广泛使用的两种植物组织特异性基因表达方法，即特定启动子驱动法和ＧAL4/ＵAS激活标签法.ﻭ１组织特异性启动子驱动法ﻭ1.1植物组织特异性启动子启动子是一段位于功能基因5 端上游的DNA序列，包含特定的保守序列,长度因基因而异。
大豆组织特异启动子的克隆与功能分析曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【摘要】采用同源序列法克隆得到了大豆根部特异性启动子、种皮特异性启动子、种子特异性启动子,核苷酸序列大小分别为2 500bp、1 832bp、1 268bp,分别具有CANNTG-motifs、GATA-box、ACGT等启动子表达元件,并分别构建了这3个组织特异性启动子的植物报告表达载体.通过农杆菌介导法将3个表达载体转入烟草NC89,通过组织化学染色和GUS基因的相对表达量分析验证3个启动子的功能.通过转化获得了根部特异性启动子转基因烟草植株11株,种皮特异性启动子转基因烟草植株4株,种子特异性启动子转基因烟草植株8株,转35S启动子启动GUS基因的阳性烟草植株7株.GUS化学组织染色结果表明,克隆得到的根、种皮、种子特异性启动子都表现为组织特异性表达,表达水平明显高于叶片、茎部、花等部位.进一步的荧光定量PCR结果显示,根部特异性启动子GUS的相对表达量在根部最高,而在茎、叶、种子、种皮、花中表达量较低;种皮部特异性启动子GUS的相对表达量在种皮最高,而在根、茎、叶、种子、花中表达量较低;种子特异性启动子GUS的相对表达量在种子最高,而在根、茎、叶、种皮、花中表达量较低,但是与35S启动子相比,这3个特异性启动子的GUS相对表达量在相应的组织均低于35S启动子.%In this study,the soybean root specific promoter,seed specific promoter and seed coat specific promoter were cloned by homologous sequence method respectively.Their sizes were 2 500bp,1 832bp and 1268bp.They had different expression elements including CANNTG-motifs,GATA-box,ACGT.Three plant expression vectors of these tissue specific promoters were constructed and transferred into Nicotiana tabacum NC89 by Agrobacterium-mediated method to prove GUS activityof different promoters.Soybean root,seed coat and seed specific promoter nucleotide sequence were isolated by PCR method.Then 11 root specific promoter transgenic plants,4 seed coat specific promoter transgenic plants,8 seed specific promoter transgenic plants,and 7 35S-promotertransgenic plants had been obtained.GUS activity assays indicated that GUS gene expression level in root,seed and seed coat were higher than leaf,shoot and flower.Further quantitative real time PCR results showed that the expression levels of GUS gene of root specific promoter in root were higher than those in stem,leaf,seed,seed coat and flower;the expression levels of GUS gene of seed coat specific promoter in seed coat were higher than those in root,stem,leaf,seed and flower;the expression levels of GUS gene of seed specific promoter in seed were higher than those in root,stem,leaf,seed coat and flower.But the expression levels of GUS of these three tissue specific promoters were lower than those of 35S promoter in each tissues.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】7页(P771-777)【关键词】启动子;组织特异性;基因表达;相对表达量分析【作者】曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【作者单位】吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S565.103启动子是调控目的基因的重要顺式作用元件。
根据启动子的功能，可以将其分为以下三种：诱导性启动子、组成型启动子和组织特异性启动子［1］。
组成型启动子表达不受外界环境的影响，所启动基因的表达具有持续性，几乎可以在多数或者全部组织中持续表达。
组成型启动子又包含异源组成型启动子和来自于植物自身的组成型启动子［2］。
如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子是典型的异源组成型启动子［3］，能调控烟草［4］、拟南芥［5］、马铃薯［6］等转基因植株中的异源基因。
色氨酸合成酶蛋白β亚基基因（PTSB1）和植物光敏色素B基因（PPHYB）是来自拟南芥植物自身的组成型启动子，Naomi等验证了这两种启动子转基因烟草的GUS活性，与CaMV35S启动子相比，发现PPHYB和PTSB1启动子的GUS活性高了一半以上［7］。
魏晶从籼稻品种明恢63中获得了PSUI1启动子，该启动子在水稻发育幼苗期、抽穗期、成熟期均能表达。
进一步研究表明，玉米Ubiquitin启动子的活性为PSUI1启动子活性的2～3倍，但其稳定性与PSUI1启动子相比较差［8］。
大量研究表明，外源目的基因在植物中持续性的表达，消耗了植物体内自身储藏的大量营养物质和能量，外源目的基因合成并积累大量异源蛋白质及代谢产物，导致植物体自身代谢紊乱，有毒物质积累，影响植株正常的生长发育［9］。
因此与组成型启动子相比，组织特异性启动子可大大减少对植物体内物质和能量的过度消耗。
目前有研究人员成功获得各种类型的组织特异性启动子。
周晓红等首次从番茄中克隆并测出番茄果实特异性启动子E81．1序列［10］。
Govender从玉米自交系‘N19’中克隆出一个茎特异性启动子［11］。
目前，在植物中克隆了果实、茎、豆荚、花等组织特异性启动子，并且广泛应用于水稻、玉米、番茄等作物中［12～14］。
但用于大豆转基因研究的组织特异性启动子报道较少。
目前的研究多集中在35S启动子启动外源抗除草剂基因，目标基因在全株的各个时期各个部位都进行表达，造成了植株整体消耗过大，影响大豆植株的正常生长发育。
因此，研究大豆组织特异性启动子对外源基因表达效率的影响，对在大豆中定向表达外源基因有着重要的理论意义和应用价值。
本研究采用同源序列法，克隆了大豆根部、种子和种皮特异性启动子，采用农杆菌介导法将3种不同的启动子的植物表达载体转化烟草进行功能分析，通过对外源基因进行分子检测和相对表达量分析，验证了不同启动子对目标基因存在特异性表达，为三个启动子在大豆或其他植物上的进一步应用奠定基础。
1 材料与方法1．1 材料大豆品种为吉农18，烟草品种为NC89，植物表达载体质粒为 pBI121－RSP、pBI121－SCSP、pBI121－SSP和 pBI121，大肠杆菌DH5α（E．coli DH5α）和农杆菌EHA105等，均由吉林农业大学植物生物技术中心提供。
1．2 大豆组织特异性启动子片段的克隆采用Plasmid Minspin HP Kit试剂盒提取植物表达载体 pBI121－RSP、pBI121－SCSP、pBI121－SSP、pBI121的质粒DNA，从大豆的幼根提取大豆基因组DNA，分别根据大豆根部特异性启动子RSP（GenBank登录号为AF520576）、种皮特异性启动子SCSP（GenBank登录号为 AF014502）、种子特异性启动子SSP的核苷酸序列（GenBank登录号为AB237643），利用 Primer Premier 5．0软件设计相应的特异性引物，引物序列见表1，引物由三博远志公司合成。
PCR条件见表2。
表1 PCR引物Table 1 Primers used for PCR注／Note：RSP：根部特异性启动子 Root specific promoter；SCSP：种皮特异性启动子 Seed coat specific promoter；SSP：种子特异性启动子 Seed specific promoter；其中下划线部分为酶切位点Underlines indicate enzyme cutting sites启动子名称Promoter name 上游引物Upstream primer 下游引物Downstream primer RSP 5′－TTTCTGCAGGACTTCCATGTGAACTTG－3′ 5′－TTTCCATGGGCTTGTGCTTATTATGCC－3′SCSP 5′－TTTGGATCCCCACTACTAATAGACGC－3′ 5′－CCCAAGCTTCTCTTTGTAATCTCACC－3′SSP 5′－GGGAAGCTTTGCTTGGATTTGGACCAG AC－3′（HindⅢ）5′－TTTGGATCCTAGGATATTGAACTA GTTCT－3′（BamHⅠ）PCR扩增产物采用V－gene凝胶回收试剂盒纯化后连入克隆载体pMD18－T Vector；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白斑提取质粒DNA，通过PCR和酶切鉴定获得重组质粒，对重组载体测序后进行BLAST分析，测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。
