西南大学本科实验教学改革行动计划项目——综合性、设计性实验项目建设项目名称：EGFP在肿瘤细胞中的表达分析--基因工程课程综合性实验项目项目负责人：杨应斌负责人所在部门：生命科学学院填表日期：2010年6月16日EGFP在肿瘤细胞中的表达分析引言利用肿瘤组织特异性启动子调控自杀基因在肿瘤组织的靶向表达，是肿瘤基因治疗研究中的一种策略。
目前常用的肿瘤组织特异性启动子有：前列腺特异性抗原（PSA）启动子、癌胚抗原（CEA）启动子、人类端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子等。
其中hTERT在85%以上的不同组织起源的各种类型的恶性肿瘤中，都可以检测到较高水平的表达，而在正常哺乳动物体细胞中，除生殖细胞等少数几种细胞可检测到活性以外，其它组织细胞均为阴性。
由于hTERT启动子和其它启动子相比，具有广谱（在大多数肿瘤细胞中有活性）、转录活性高、靶向性好等优点，因而被认为是肿瘤基因治疗领域里较有潜在应用价值的启动子。
现已有使用hTERT启动子成功对骨肉瘤、结肠癌、肝细胞肝癌等恶性肿瘤进行靶向基因治疗的报道。
人类骨髓干细胞不具有端粒酶活性已经被报道，然而Burns JS的研究发现，长时间在体外培养的干细胞可能发生癌变，其原因是其开始表达端粒酶。
而肿瘤细胞之所以能够无限增殖，也与其有比正常细胞活跃的端粒酶有关。
hTERT基因的转录机制严格控制着端粒酶的活性的表达，而hTERT基因的转录被hTERT基因启动子调控，hTERT基因启动子是一种在肿瘤细胞中特异启动的启动子，因此，我们构思可以利用hTERT基因启动子，在其下游接入自杀基因，并将其克隆入慢病毒载体中，再借助慢病毒将此融合基因导入骨髓干细胞中，筛选出含有由hTERT基因启动子控制自杀基因的供体骨髓干细胞，当这种移植的骨髓干细胞在植入体内后有形成肿瘤细胞的趋势时，就可以通过自杀基因的表达使用前体药物对有瘤变趋势的骨髓干细胞进行杀灭，这样既不会对受体产生副作用，又可以由此解决骨髓干细胞移植的安全性问题。
因此构建一种靶向表达自杀基因的载体，这种载体转染骨髓干细胞后能很容易筛选，并且被转染的骨髓干细胞能稳定表达自杀基因且不会发生丢失，这将成为骨髓干细胞移植瘤变研究中关键且必要的步骤。
然而，在本研究的前期实验中，我们发现野生型hTERT启动子如其他已知肿瘤组织特异性启动子一样，仍然存在着肿瘤组织转录活性与靶向性较差的问题，而不能保证将导入体内的自杀基因限制在肿瘤细胞中特异性地表达。
因此，如何利用肿瘤细胞中特异性的表达上调因子结合元件对hTERT启动子进行顺式修饰，以提高hTERT启动子在骨髓瘤变细胞中的转录活性是本节研究所关注的重点。
据研究表明，c-Myc基因的大量扩增是促使癌细胞无限增殖的重要原因，转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子上的E-box结合后可以启动hTERT基因的在肿瘤细胞中特异性表达，但在正常细胞中的表达较低甚至缺乏。
通常情况下，在肿瘤细胞中c-Myc表达占优势，c-Myc 转录因子（c-Myc或与Max 蛋白形成异二聚体复合物）在识别和连接E-box后，激活hTERT基因转录；而在正常细胞中mad1表达占优势，mad1（或mad1和Max 蛋白形成异二聚体复合物）和c-Myc竞争识别和连接E-box后，抑制hTERT 基因转录。
进一步的研究表明，在hTERT启动子核心序列上含有两个E-box（5＇-CACGTG-3＇），分别位于hTERT基因起始密码子ATG上游-34和-242位置上.敲除-34 位E-box，可使启动子活性下调10倍，与无启动子时的表达水平相似，但缺失或敲除-242bp 位置处E-box时，hTERT启动子活性只是不同程度的下降。
说明hTERT启动子核心序列3＇端位置的E-box保守序列对维持hTERT启动子功能具有更加重要的作用。
因此，我们假设c-Myc转录因子与hTERT启动子上的结合元件（E-box）结合（特别是与hTERT启动子核心序列3＇端位置处的E-box保守序列结合）后可以上调hTERT的表达，那么增加hTERT启动子序列上E-box元件（特别是hTERT 启动子３＇端的E-box元件）的数量后，势必会引起转录因子c-Myc（或c-Myc 与其它转录因子形成的二聚体复合物）和转录抑制因子mad1（或mad1与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子结合机会增加，最终导致hTERT 启动子在肿瘤细胞中转录活性得到进一步的提高。
材料准备1质粒、菌株和细胞质粒pLenti6/V5-D-TOPO (invitrogen)质粒pUC-ModhTERT （实验室自行化学法制备）质粒pUC-WThTERT （实验室自行化学法制备）质粒pGL3-basic(Promega)大肠杆菌菌株ER2925(NEW GENE)大肠杆菌菌株stab3 (invitrogen)阳离子脂质体liperfectamine2000(invitrogen)293T细胞株（由本实验室提供）2 主要试剂氯霉素(购于GIBCO )卡那霉素(购于GIBCO)酵母提取物（购于Oxoid）胰蛋白胨（购于Oxoid）质粒DNA抽提试剂盒（购于Promega）DNA凝胶片段回收试剂盒（购于Promega）琼脂糖(购于Sigma.Co) Goldenview (购于赛百盛)Tris: （购于XX生工）EDTA: （购于XX生工）HCL: （购于XX生工）甘油：（购于XX生工）3相关工具酶ＣlaI (购于Promega)BamHI(购于Promega)T4 DNA 连接酶(购于TaKaRa)Pyrobest DNA Polymerase (购于TaKaRa)4主要实验设备与仪器准备PCR仪：TC-312（TTECHNE）恒温摇床：（XX科学仪器厂）生化恒温培养箱：（XX跃进医疗器械一厂）恒温水浴加热器（汉科学仪器厂）超净工作台：（苏净安泰中国）普通高速离心机（Appendorf 5417）低温冷冻离心机（Beckman）电泳仪：（六仪器厂）微量蛋白质核酸定量仪（Appendorf）凝胶成像系统(Bio-Rad USA)低温冰箱NV-6382E （日本/NV公司）恒温水浴加热器（XX科学仪器厂）紫外分光光度计U-1800 （日本日立公司）超纯水器D7035 （BARNSTEAD THERMOLYNE）5试剂配制①LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制1)LB培养液用天平称取1g酵母提取物、2g胰化蛋白胨、1gNaCl于500毫升的三角烧瓶中，加入200毫升去离子双蒸水溶解，用5mol/L NaOH(约0.2mL)调节pH值至7.0，然后120℃高压蒸汽灭菌20min。
2)LB琼脂平板的配制：先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入琼脂糖3g ，同法高压蒸汽灭菌20min。
从高压灭菌器取出培养基时应轻轻旋动以使熔解的琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中，应使培养基降温至50℃时，加入抗生素等不耐热的物质。
为避免产生气泡，混匀培养基时应采取旋动的方式，然后可直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
在90mm直径的培养皿需加入30mL培养基，培养基完全凝结后，应倒置平皿并贮存于4℃备用。
3) 抗生素贮存液的配制氯霉素（34mg/mL）: 用少于10毫升的无水乙醇溶解340mg氯霉素，最后定容至10mL。
分装入1.5毫升的离心管中, 每管1毫升,于-20℃贮存备用。
氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)：用少于10毫升的双蒸水溶解1克氨苄青霉素,最后定容致10毫升, 再分装入1.5毫升的离心管中, 每管1毫升,于-20℃贮存备用。
4) 含抗生素液体培养基的配制氨苄青霉素液体培养基: 在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氨苄青霉素贮存液1毫升,混匀即可.氯霉素液体培养基: 在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氯霉素贮存液10毫升,混匀即可.5) 含抗生素固体LB培养基的配制先按上述LB固体培养基配制的方法配制2瓶200mL培养基,经灭菌后待液体温度降至55-60℃时分别加入氯霉素、氨苄青霉素贮存液便得到相应的抗生素固体培养基6) 新鲜氯化钙转化液的配制在200mL纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22滤器过滤除菌，用15mL的离心管分装成10mL小份贮存于－20℃。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mL，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。
6) 50×Tris-乙酸(TAE)的配制50×浓贮存液：称量242g Tris 碱,量取57.1mL 冰乙酸,100mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL。
7) 1×TAE的配制将配置好的50×TAE稀释50倍即得到1×TAE６感受态大肠秆菌的制备①保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5a、stab3及ER2925用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。
②挑取单菌落，接种于2.0mL LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。
③取0.5mL 过夜培养液，接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。
（注：以下操作均应在冰浴中进行。
）④将培养液分入两个50mL离心管中，4℃，离心10min（4000rpm），弃去25mL悬浮30min。
上清，用冰浴的0.1M MgCl2-甘⑤4℃离心, 离心10min（4000rpm），弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2油溶液1mL悬浮。
⑥以100μL/管分装入1.5mL离心管中，-70℃冻存备用。
2.2.9质粒的转化①取2管（100μL）贮存于-70℃DH5α感受态ER2925大肠杆菌置于冰上待用；②分别加入pLenti6/V5-D-TOPO和pUC57-ModhTERT、pUC57-WThTERT （0.5μg/μL）质粒5μL，旋转混匀，冰浴20min；③迅速放入42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；④加入LB液体培养基600μL，于37℃缓摇孵育90min；⑤培养结束后，12000rpm离心15秒，倾去上清，保留100μL左右的菌液；⑥将100μL的菌液涂布于含有氯霉素(34μg/m1)抗性的平板LB培养基中,于37℃温箱孵育至胶表面没有液体流动时（约2hr），然后翻转平皿37℃倒置培养16hr。
