TUNEL检测方法

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）是一种常用于检测凋亡细胞的方法。

TUNEL检测法通过标记凋亡细胞DNA末端的dUTP，可以检测出凋亡细胞的数量和分布。

TUNEL细胞凋亡率的计算方法如下：
1. 计算TUNEL阳性细胞数：在显微镜下观察到的凋亡细胞，通过染色后在光学显微镜下进行计数。

2. 计算总细胞数：通过显微镜下观察，在与TUNEL阳性细胞所在的组织切片中，对所有细胞进行计数。

3. 计算凋亡细胞率：凋亡细胞率= TUNEL阳性细胞数÷总细胞数×100%。

例如，如果在一个组织切片中，TUNEL阳性细胞数为100个，总细胞数为1000个，则凋亡细胞率为：
凋亡细胞率= 100 ÷1000 ×100% = 10%
需要注意的是，TUNEL法只能检测凋亡细胞的存在，不能区分凋亡细胞的类型（如程序性细胞凋亡或坏死），也不能确定凋亡细胞的数量。

因此，在使用TUNEL法进行凋亡细胞检测时，需要结合其他方法和技术进行综合分析。

TUNEL检测中文名称：TUNEL检测英文名称：terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay;TUNEL assay定义：即原位末端转移酶标记技术。

凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。

原理细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。

细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

实验方法1. 对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。

b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

d. 用PBS或HBSS洗涤一次。

e. 加入含0.1％Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。

f. 转步骤5。

2. 对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。

细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。

因此，对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。

本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。

二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。

它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端，并通过荧光或酶标记来检测。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 用缓冲液进行处理，使得DNA断裂末端暴露出来；3. 加入TdT和dUTP标记物，使得dUTP与DNA断裂末端连接；4. 洗涤样品，并加入抗dUTP抗体标记物；5. 洗涤样品，并观察荧光或颜色变化。

三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。

它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化，通过Annexin V结合检测细胞凋亡。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Annexin V标记物，使得其与PIP2结合；3. 加入PI染色剂，使得细胞核染色；4. 观察荧光或颜色变化。

四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Caspase底物和缓冲液，使得Caspase底物被水解；3. 观察荧光或颜色变化。

五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并提取其中的DNA；2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并观察条带形态。

六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并进行适当处理；2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。

七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法，每种方法都有其特点和优缺点。

鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。

凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。

因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。

本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。

一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。

该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。

该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。

二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。

该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。

该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。

三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。

该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。

该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。

四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。

该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

一、TUNEL实验试剂(1)DeadEnd™Fluorometric TUNEL System试剂盒购自Promega公司(产品编号G3250)(2)二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司（产品编号80139118，CAS号108-38-3，500ml）(3)无水乙醇购自中国上海生工生物有限公司（产品编号ET0737-500ml）(4) 过氧化氢购自上海生工生物有限公司(产品编号H1976-500ml)(5) Proteinase K购自上海生工生物工程技术服务公司(产品编号BSP169-2ml)(6)多聚甲醛购自上海生工生物有限公司（产品编号PB0684-500g）(7) Propidium iodide购自Sigma（产品编号P4170-10MG）(8) SlowFade® Gold antifade reagent购自Life Technologies（产品编号36936）二、具体实验步骤A. 石蜡包埋组织预处理：1.二甲苯5min (500ml二甲苯)2.二甲苯5min（500ml二甲苯）3.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）4.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）5.80%乙醇5min（500x0.8=400ml无水乙醇）6.70%乙醇5min（500x0.7=350ml无水乙醇）7.PBS 5min（500ml）8.PBS 5min（500ml）9.PBS 5min（500ml）10.4%多聚甲醛in PBS，15min11.PBS 5min（500ml）12.PBS 5min（500ml）13.Proteinase K in PBS (100ul每个样品，共6ml), 8-10min14.PBS 5min（500ml）15.PBS 5min（500ml）16.4%多聚甲醛in PBS，5min17.PBS 5min18.PBS 5min共105分钟，实际约2个小时B. 凋亡检测1.每个样品，100ul平衡缓冲液覆盖细胞，室温5-10分钟2.在平衡细胞的同时，在冰上解冻核苷混合物，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应（见4.E节）的rTdT孵育缓冲液。

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

一、TUNEL试剂盒说明凯基一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是绿色荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，可用荧光显微镜检测。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。

本试剂盒特点●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，只需一步染色反应，洗涤后即可观察。

●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。

●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。

●快速操作：仅需约1-2个小时即可完成整体操作。

●方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果。

●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性●应用范围广：可以用于冷冻或石蜡切片中的组织细胞凋亡检测，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

二、TUNEL试剂盒组分注意事项1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。

2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。

3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。

4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。

5. 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸。

三、操作流程概览细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本四、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 10），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。

然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp 核小体DNA多聚体。

DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。

低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。

在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

毛地黄植物是地高辛的唯一来源。