TUNEL染色

Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。

TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。

以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。

2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。

步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。

2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。

3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。

4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。

步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。

2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。

3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。

步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。

2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。

3.在37℃下孵育1-2小时。

步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。

2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。

步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。

2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。

总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。

它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。

整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。

tunel 染色原理
隧道染色原理是一种用来观察细胞结构和功能的重要技术。

它基于荧光染料的特性，在细胞内部或细胞表面标记特定的分子或结构，以便研究者可以通过显微镜观察其位置和行为。

在隧道染色原理中，首先需要选择合适的荧光染料。

这些染料通常具有特定的光谱特性，可以发射出明亮的荧光信号，以便在显微镜下进行观察。

常用的荧光染料有荧光素、罗丹明和荧光蛋白等。

接下来，需要将荧光染料引入细胞内或细胞表面。

这可以通过多种方法实现，如细胞渗透、细胞转染或直接染色等。

不同的方法适用于不同类型的细胞和研究目的。

染色后的细胞可以通过荧光显微镜观察。

荧光显微镜配备了特殊的滤光片，可以选择性地捕捉特定波长的荧光信号。

这样，就可以将荧光信号与细胞结构或分子相对应，从而确定它们的位置和行为。

隧道染色原理在生物学研究中应用广泛。

例如，在细胞生物学中，研究者可以使用隧道染色技术来观察细胞器的分布和动态变化。

在分子生物学中，隧道染色可以用来标记特定的蛋白质或核酸序列，以研究它们在细胞内的功能和相互作用。

隧道染色原理是一种重要的技术，可以帮助研究者观察和理解细胞的结构和功能。

通过选择合适的荧光染料，并结合荧光显微镜的使用，隧道染色技术为生物学研究提供了强大的工具。

随着技术的不
断发展，相信隧道染色原理将在未来的研究中发挥越来越重要的作用。

TUNEL染⾊相关疾病：产品名称：罗⽒(Roche)公司Tunel试剂盒英⽂名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法⼀、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是⽤来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作⽤下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3‘-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者⼜与HRP底物⼆氨基联苯胺（DAB）反应产⽣很强的颜⾊反应（呈深棕⾊），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因⽽在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA断裂，因⽽没有3?-OH形成，很少能够被染⾊。

本试剂盒适⽤于组织样本（⽯蜡包埋、冰冻和超薄切⽚）和细胞样本（细胞涂⽚）在单细胞⽔平上的凋亡原位检测。

还可应⽤于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双⾊法确定细胞死亡类型和分化阶段。

⼆、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、⼩型染⾊缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻⽚或封⼝膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；⾃备试剂：PBS、双蒸⽔、⼆甲苯、梯度⼄醇（100、95、90、80、70%）、DAB⼯作液（临⽤前配制，5 µl 20×DAB+1µL 30%H2O2+94 µl PBS）、Proteinase K⼯作液（10-20µg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临⽤前配制）、苏⽊素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

TUNEL 凋亡染色
参照罗氏公司的TUNEL凋亡试剂盒说明书进行并适当改进
1、石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；
2、蒸馏水缓慢冲洗后室温下干燥；
3、切片置于250ml柠檬酸（0.1M，pH6.0，10.505g C6H8O7.H2O+500ml H2O）中微波加热至沸腾，静置5min后加入100ml ddH2O；
4、15min后取出切片，标本上滴上10%山羊血清（0.5%BSA），于37°C封闭15min（室温封闭45min）；
5、TUNEL试剂1和试剂2按照1:9比例充分混匀，离心，滴加至标本（试剂覆盖组织即可），37°C孵育1h；
6、PBS清洗3次，每次10min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜摄像。

（5、6需避光操作）
7、去掉盖玻片，PBS清洗3次，每次5min；
8、滴加POD至标本，37°C孵育30min；
9、PBS清洗3次，每次5min，DAB显色；
10、苏木素复染，光学显微镜摄像。

凋亡指数（AI）计算：采用IPP随机选取5个高倍（X400）视野，计数至少1000个细胞，阳性细胞占细胞总数的百分比即为AI。

数据采用均数+/-标准差表示，采用SPSS17.0统计软件，多个样本均数比较采用ANVOA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较，以p<0.05有差异统计学意义。

Tunel染色操作流程及步骤：实验准备：1、固定溶液：4%的聚甲醛。

2、封闭溶液：3%H2O2的甲醇溶液，共计4ml。

其中30%H2O2 ：甲醇为1:9即：400ul30%H2O2+3.6ml甲醇。

3、透化溶液：0.1g柠檬酸+100mlddH2O+100ulTriston[1]。

实验步骤：1、磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次每次5min[2-3]。

2、固定溶液：4%的聚甲醛固定1h[3-5]。

3：PBS洗4次每次7min[3]。

以下步骤全部避光:4、在15-25℃下与封闭溶液200ul孵育10min[3,6]。

5、PBS洗4次每次7min[3]。

6、透化溶液5min（4℃摇床）。

7、PBS洗4次每次7min[3]。

8、tunel溶液配制瓶1：瓶2=1:9（遮光），每孔加200mltunel混合物孵育60min[3,7] 。

8、PBS洗4次每次7min[3]。

9、加DAPI 200ml 15min[3,8]10、PBS洗4次每次7min[3]。

11、荧光显微镜拍片。

待学习…心得体会及注意事项：1、因柠檬酸量太少直接配制所需溶液量误差较大所以配制100ml体系。

2、洗去培养液。

3、加完液后放在摇床上。

4、每孔加200ul4%的聚甲醛。

5、为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

6、封闭细胞内的氧化酶。

7、染凋亡细胞的DNA。

8、DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，能够与DNA强力结合的荧光染料，用于荧光显微镜对比观测。

所有细胞DNA均可染色。

目的及原理目的：检测细胞凋亡原理：TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。

凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。

细胞tunel染色步骤细胞 Tunnel 染色步骤细胞Tunnel 染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，通过染色分析可以定量评估细胞凋亡的程度。

本文将介绍细胞Tunnel 染色的步骤。

1. 固定细胞需要将待检测的细胞固定在载玻片上。

固定可使用4%的无水乙醇或4%的甲醛进行，固定时间一般为10-30分钟。

2. 透化细胞固定后的细胞需要进行透化处理，以便Tunnel 酶能够进入细胞内部。

透化可使用0.1%的Triton X-100进行，透化时间一般为5-10分钟。

3. 准备 TUNEL 反应液TUNEL 反应液是细胞Tunnel 染色的核心。

一般来说，TUNEL 反应液包含 Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 酶和标记有荧光或酶的dUTP。

根据实验需求，可以选择不同的标记物，如荧光染料FITC、Rhodamine 或者酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）。

4. 进行 TUNEL 反应将TUNEL 反应液加到透化后的细胞上，尽量覆盖整个玻片表面。

然后，将玻片置于湿度高的环境中，如湿箱或湿化瓶中，温度为37°C。

反应时间一般为1-2小时。

5. 停止反应反应结束后，需要停止TUNEL 反应，以保证结果的准确性。

停止反应可使用缓冲液，如PBS缓冲液或甘氨酸缓冲液，反应时间一般为10分钟。

6. 染色在停止反应后，需要对细胞进行染色，以便观察和分析。

染色可使用荧光显微镜或透射电子显微镜进行观察。

如果使用荧光显微镜，可以直接观察细胞的荧光信号。

如果使用透射电子显微镜，需要进行金粒子染色，将金粒子标记的抗体与TUNEL 反应产物结合，形成可见的电子密度。

7. 细胞计数和分析对染色后的细胞进行计数和分析。

可以使用图像处理软件对细胞进行定量分析，评估细胞凋亡的程度。

可以通过测量染色阳性细胞的数量，计算细胞凋亡指数（Apoptosis Index）。

细胞Tunnel 染色是一种简单而有效的细胞凋亡检测方法，可以广泛应用于生物医学研究中。

tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。

Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。

这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。

Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。

在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。

Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。

通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。

Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。

以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。

•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。

Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。

•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。

Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。

Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。

•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。

•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。

•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。

相关疾病：•脱水产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。

通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。

本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。

正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。

在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。

Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。

通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。

TUNEL分析TUNEL方法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口标记）源自完整固定的细胞核DNA 裂解部位标记（如Gavrieli et al. 1992)。

该法可用于组织切片、玻片上细胞生长、流式细胞计量术分析，用于组织切片的改进程序由Naik 及其合作者提出(Naik et al. 1996) ，叙述如下1、组织切片的TUNEL 染色1）取下组织，立即用新制备的4％甲醛固定，室温过夜。

用多聚甲醛(EM 级）制备4％的甲醛溶液，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛，在通风橱中加热至50 ~ 60℃．加几滴1 moL/L NaOH 使固体全部溶解。

多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。

加100 ml 2 的2 x PBS, 过滤固定液。

甲醛储存液应在每次实验前新配。

2) 通过50% 、70%、80% 、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分钟）使组织脱水3) 用石蜡包埋组织，制备5μm厚的切片，固定于玻片上，将石蜡切片70℃加热10分钟或58 ~ 60℃加热30 分钟去除石蜡4) 通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯5 分钟2 次， 96％乙醇3 分钟2 次，然后90% 、80% 、70% 、50 ％，双蒸水各3 分钟5) 在冷的4％甲醛中后续固定切片5 分钟，用pH7.2 的PBS 清洗3 次，每次5 分钟6) 室温下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 处理玻片10 分钟，用PBS 清洗3 次7) 用0.5%H2O2的PBS 溶液室温处理20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。

8) 用补充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反应缓冲液(GIBCO/BRL）预孵育切片。

每个切片上加27 μl 溶液，用已裁成合适大小的Parafilm 膜覆盖。

5x TdT 反应缓冲液500 mmol/L 二甲胂酸钾， pH7.2l0 mmol/L CoCl2l mmol/L DTT9) 室温孵育10 分钟后，取下Parafilm 膜，用纸巾吸去水。