人血清中分离纯化鸡IgG、IgM的实用方法

IgG分离、纯化与鉴定实验原理操作步骤：1、取2.5ml血清，加pH7.0 PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。

2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置20min。

4、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。

5、于沉淀中加5ml PBS，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置20min。

6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。

7、用1ml PBS溶解沉淀，装入透析袋。

8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。

8、SephadexG50 除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。

9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。

根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。

抽干，改用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。

再改用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。

本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。

10、装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。

然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约11mL处左右为止，在床面上放一张圆形滤纸片。

组织中igg的检测方法是
IGG检测方法是一种常用的免疫学方法，用于检测特定抗体IgG的存在和浓度。

以下是一种常见的IGG检测方法：
1. 血清收集：从被测对象采集血液样本，通常采用静脉血。

2. 血清分离：将采集的血液样本放置在试管中，通过离心等操作分离血清。

3. 定量测定：利用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，将被测血清样本与特定的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。

4. 洗涤：通过多次洗涤步骤，去除未结合的成分，以降低非特异性背景信号。

5. 探针结合：添加与IgG结合的二抗或探针，使其与已结合的抗体形成二抗-抗体复合物。

6. 信号检测：通过添加底物，如酶底物，使其与上述二抗-抗体复合物反应产生可定量测量的信号。

7. 分析结果：根据所测定的信号强度，可以判断被测血清中特定抗体IgG的存在与浓度。

通过这种IGG检测方法，可以快速、准确地确定组织中特定抗体IgG的水平，帮助诊断和预防多种疾病。

IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。

但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。

通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。

因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。

之前根据载量估计一下需要的柱子体积。

实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。

下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。

材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。

如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至 1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至 1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。

4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。

血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。

IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。

本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。

实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。

- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。

2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。

- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。

3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。

- 打开流量，并在结合完毕后关闭。

- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。

4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。

- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。

5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。

结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。

通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。

分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。

人血清IgG分离纯化方法探讨2 IgG的纯化方法根据IgG的不同特性，IgG的纯化方法主要有以下几种：2．1 饱和硫酸铵盐析法盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一．因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高．但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出．硫酸铵是盐析最常用的无机盐，其主要特点是溶解度大，随温度变化小；对蛋白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性；溶解于水时不产生热量，价格低廉，但在碱性环境中不能用硫酸铵作为沉淀剂进行盐析反应．在血清中加入硫酸铵，当饱和度为28 ～33 时，优球蛋白析出；33 ～55 时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%后，白蛋白析出，这是硫酸铵分析沉淀血清蛋白的一般规律[3]．2．2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是利用有机溶剂能破坏溶质分子周围形成的水化层，使溶质分子脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度；而且有机溶剂的介电常数比水小，随着有机溶剂的加入，整个溶液的介电常数降低，带电溶质分子之间的库仑引力逐渐增强，于是发生相互吸引而聚集．一般来说，溶质分子量越大，越容易被有机溶剂沉淀，发生沉淀所需要的有机溶剂浓度越低[7]．在这主要介绍辛酸法．2．3 聚乙二醇(PEG)置换法水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇(PEG)及右旋糖酐．水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制还不清楚，大致有如下解释：聚合物与蛋白质形成共沉物；聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；聚合物与蛋白质形成复合物．此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等．PEG在浓度为3 ～4时可沉淀去除了蛋黄脂磷蛋白及脂质，6 ～7可沉淀IgM，8 ～12 沉淀IgG，12 ～15 沉淀其他球蛋白，25 则沉淀白蛋白．在10mL人血清中加入等量0。

血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。

IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。

血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。

许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。

而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。

这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。

当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。

钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。

由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。

盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。

盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。

自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。

因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。

实训血浆中IgG的分离纯化［任务描述］IgG是免疫球蛋白（简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万～16万。

IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。

血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，致使在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。

其中最常用的盐析剂是硫酸铵，本实训任务利用硫酸铵饱和溶液沉淀并分离目的蛋白质。

［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。

2.收集硫酸铵盐析血浆中的IgG工作中的必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。

3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。

（1）材料准备新鲜动物血清（2）试剂饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100％饱和度，使用时用浓NH4OH调至PH7.0。

0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）其配制方法如下：①配A液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（称取磷酸氢二钠5.37g加去离子水定容至100mL）②配B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（称取磷酸二氢钠3.12g加去离子水定容至100mL）③取A液约72mL，取B液约28mL，然后将这两种溶液边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100mL浓度为0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液备用。

（3）器具离心机、烧杯（500mL和250mL）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。

IgY提取纯化方法鸡卵黄中含有水分48.0%，蛋白质17.8%和脂肪30.5%，其中大部分脂肪与结合以脂蛋白的形式存在。

卵黄包括水溶性蛋白γ-卵黄球蛋白，α-卵黄球蛋白，β-卵黄球蛋白。

γ-卵黄球蛋白和各种脂，如LDL、HDL等。

所以分离纯化IgY的关键是除去卵黄中高含量的脂及脂蛋白。

早在20世纪60年代初，科学家就发现鸡卵黄中存在IgG抗体，其含量与血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视，显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。

直到80年代初，Polson 和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇（PEG）提取法和硫酸葡聚糖提取法，有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应用在生物学的许多领域。

1 IgY的分离分离的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分（Water Soluble Fraction，WSF）。

常见分离方法有以下几种：1.1 有机物沉淀法聚乙二醇（PEG）法和硫酸葡聚糖（DS）法是比较常用的方法。

一般采用PBS或TBS作缓冲液，将卵黄液稀释5倍，加入一定比例的聚乙二醇6000（以3.5%最佳）或硫酸葡聚糖，脂类即发生沉淀，IgY保留在上清液中。

Schwarzkopf C等在比较了6种分离方法后认为硫酸葡聚糖法具有快速、有效、简便等优点[2]。

1.2 有机溶剂抽提法脂类易溶于有机溶剂，可采用氯仿等进行分离。

一个经TBS 冲洗过的鸡蛋黄制成15mL蛋黄液，加入40mLTBS充分混合后加入40mL氯仿，冷冻离心，分三相。

弃去氯仿层，保留水层，中间的半固体相用40mLTBS萃取，取水层，与前一步水层合并即为水溶性组分Hamada将蛋黄溶于等体积的盐溶液中，再与二倍体积的氯仿混合，离心即得水溶性组分。

还有学者使用丙酮分离获得水溶性组分。

1.3 天然胶法Hatta等认为一些天然胶如卡拉胶和黄原胶可用于卵黄抗体分离。

低温乙醇法从‎人血清中提取‎免疫球蛋白一、实验目的利用低温乙醇‎法从人血清中‎分离出免疫球‎蛋白（Ig），并获得副产物‎血清白蛋白。

二、实验原理（1）低温乙醇法C‎o hn6法：美国哈佛大学‎Ｅ·Ｊ·COHN教授‎研究组，在短短两年建‎立了低温乙醇‎分段提取法。

方法原理：往蛋白水溶液‎中加入中溶性‎有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水‎分子的活度，降低溶液的介‎电常数，从蛋白分子周‎围排斥水分子‎，使蛋白分子之‎间通过极性基‎团的相互作用‎，在范德华力作‎用下，发生凝聚。

不过由于有机‎溶剂存在，降低了蛋白分‎子表面憎水基‎团的作用，因而引起蛋白‎分子聚集的主‎要极性基团的‎相互电荷之间‎的引力。

（文献20）分离过程中，二法通过五个‎因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋‎白质得以分离‎。

这五个因素及‎其各自的作用‎是；①乙醇：使蛋白质分子‎“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电‎点时易于沉淀‎；②电解质浓度：在低离子浓度‎下，对蛋白质溶解‎度有较大影响‎；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越‎小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对‎蛋白质的变性‎作用。

同时，蛋白质溶解为‎吸热反应，溶解度随温度‎上升而增高。

经实验得知，利用低温乙醇‎法能将血清蛋‎白分成六个组‎分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋‎白IgG主要‎存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb‎主要存在于Ⅴ中。

(2) Cohn氏9‎法；该法对Coh‎n氏6法的组‎分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离‎和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。

其工艺流程见‎图:第1 / 8页乙醇法生产中‎所用的乙醇是‎通过予冷、慢速搅拌滴入‎的。

其体积可按下‎式计算：式中V＝所需乙醇体积‎；V0＝原来溶液体积‎；C 1＝原来溶液乙醇‎浓度；C2＝所需达到乙醇‎浓度；C3＝加入乙醇的浓‎度。

三、材料和试剂3.1 血清：100 mL3.2 相关试剂：95%乙醇，pH4. 0醋酸盐缓冲‎液，磷酸盐缓冲液‎Ⅰ，磷酸盐缓冲液‎Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液‎，1 mol/L NaHCO3‎，生理氯化钠溶‎液，麦芽糖，3.3 实验仪器：四、方法与步骤基本思路：第2 / 8页血清的初处理‎——利用Cohn‎6法得到组分‎Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn‎9法得到Ig‎G——IgG沉淀的‎保存（浓缩蛋白液或‎冻干品）——Ig物理性状‎及生化检定（蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性）4.1 血清的初处理‎（文献[4]，名词.txt中关于‎血清的部分）（1）将血清从冷冻‎箱（-5C至-20℃）取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解‎（2）在室温下使之‎全溶。

IgM的纯化大多数IgM类抗体是优球蛋白不溶于水，故可用双蒸水透析纯化IgM。

对那些溶于水的IgM类抗体可用饱和硫酸铵沉淀。

沉淀后可以采用颗粒排斥层析法(凝胶过滤) 进一步纯化。

颗粒排斥层析(size-exclusion chromatography)法又称分子筛层析或凝胶过滤，是利用微孔凝胶分离不同大小分子的抗体，可用于样品中IgG和IgM的分离，常用于对硫酸铵粗提物的进一步纯化。

通过该法纯化所得抗体可用于Ig分子片段的制备、FITC、生物素或同位素标记。

IgM类抗体最好用硼酸缓冲液进行透析并保存，有些IgM类抗体易从溶液中析出，实验中应密切观察。

IgM为五聚体，反复冻溶可能会使五聚体打开成单体，影响抗体的功能，因此-70℃保存时，加适量甘油，有助于保持抗体稳定。

PH4.2~4.5有利于非IgG成分沉淀(接近杂蛋白的等电点），如PH大于4.8，则白蛋白和AB球蛋白沉淀不完全。

一、材料和试剂1.抗血清，杂交瘤腹水或其上清，硫酸铵沉淀粗提γ球蛋白。

2.含0.02%NaN3的硼酸缓冲液，PBS。

3.透析袋；26mm×900mm层析柱。

4.适当筛孔的颗粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。

5.蛋白透析、SE 层析和SDS-PAGE所需的其他试剂和器材。

二、操作步骤1.待提取样品11，000～13，000r/min(15，000～20，000×g)，4 ℃或室温离心，除沉淀。

2.上清液对双蒸水透析4℃24h。

3.11，000～15，000r/min4℃ 或室温离心1h，留沉淀。

4.制备SE凝胶层析柱，以硼酸缓冲液平衡。

5.将步骤3沉淀或饱和硫酸铵粗提γ球蛋白以3～5ml硼酸缓冲液溶解，缓慢加样。

6.以硼酸缓冲液洗脱蛋白质，并收集100管(每管为柱床体积的1%)，IgM在洗脱液的第一个蛋白峰。

7.收集Ig蛋白峰，分别合并，透析浓缩，紫外分光光度计OD280nm测定Ig含量，SDS-PAGE鉴定 IgM纯度。

血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。

二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。

要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。

2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。

而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。

这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。

3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。

实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。

盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。

即称为该蛋白质盐析的饱和度。

4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。

向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。

igg分离纯化和鉴定分离纯化和鉴定是在生物技术领域中常用的实验技术，用于提取目标物质并确定其纯度和特性。

下面以IGG为例，介绍分离纯化和鉴定的步骤和方法。

分离纯化IGG的第一步是蛋白质提取。

可以选择适当的提取缓冲液，将IGG所在的样品（如血浆或细胞培养液）与提取缓冲液进行适当的混合，使细胞或组织中的蛋白质释放出来。

提取后，可以使用离心等方法去除杂质。

将混合物进行离心，使得IGG和其他蛋白质分离。

离心后，可以将上清液取出，其中含有较高纯度的IGG。

为了进一步提高IGG的纯度，可以使用亲和层析等技术。

亲和层析是利用IGG与特定配体之间的亲和力进行分离的方法。

可以将配体固定在柱子上，然后将提取的上清液通过柱子，IGG会与配体结合，其他蛋白质则流过。

最后，通过改变柱子的条件，如改变pH值或添加特定溶剂，可以使IGG与配体解离，从而获得纯净的IGG。

获得纯净的IGG后，需要对其进行鉴定。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE和Western blotting。

SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量分离出来，可以通过与已知分子量的标准蛋白进行比较，确定IGG的分子量。

Western blotting则可以通过与特异性抗体的结合来确认IGG的存在。

除了分子量和存在性，还可以使用其他方法对IGG进行鉴定，如免疫荧光和ELISA等。

免疫荧光可以通过特异性抗体与IGG结合后的荧光信号来检测IGG的存在。

ELISA可以通过与特异性抗体的结合来定量IGG的含量。

总的来说，分离纯化和鉴定IGG是一个复杂的过程，需要使用多种技术和方法。

通过合理的实验设计和操作，可以获得高纯度的IGG，并对其进行准确的鉴定。

这些技术的应用不仅可以用于IGG的分离纯化和鉴定，还可以应用于其他蛋白质的研究和应用中。

实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。

原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。

IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。

血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。

许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。

而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。

这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。

当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。

但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。

由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。

盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。

盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。

自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。

因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。

浅析血清IgG、IgA、IgM测定方法及临床意义张英辉摘要：目的掌握IgG、IgA、IgM测定方法及临床意义。

方法采集标本，运用免疫散射比浊法测定血清中IgG、IgA、IgM，送检。

结论测定免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）能够提供有关体液免疫状态的重要信息，预见原发性免疫缺陷病，具有重大的临床意义。

关键词：IgG；IgA；IgM；测定方法；临床意义IgG、IgA、IgM是三种免疫球蛋白，也就是抗体。

三种抗体结构不同，功能亦不同。

IgG是主要的再次免疫反应抗体，IgM是主要的初次免疫抗体，IgA是粘膜免疫中的主要分泌型抗体。

1测定方法1.1检测原理免疫球蛋白是由浆细胞分泌的，是免疫系统与抗原接触后的体液免疫反应物。

采用免疫散射比浊法检测，检测原理为人体液标本中的蛋白与特异性的抗体形成免疫复合物。

这些免疫复合物会使穿过标本的光束发生散射。

散射光的强度与标本中IgA／G／M的浓度成正比。

与已知的标准浓度对比即可得出结果。

计算公式为：IgA／G／M浓度（g／L）=A样品／A标准×标准液浓度。

1.2标本采集1.2.1采血方法：空腹不抗凝静脉血、肝素或EDTA抗凝血浆2～3ml、脑脊液。

新鲜的尿液也适用于IgG测定，如要分析对应的血清和脑脊液样品，则应同时抽取。

1.2.2标本处理：以2500～3000r／min离心6～10min，分离血清上机测定[1]。

若标本不能及时检测，将分离的血清冷藏于2～8℃的冰箱内保存。

1.2.3标本保存：使用新鲜或冰冻的血清样本或脑脊液，2～8℃保存不超过8d，-20℃条件下保存不超过3个月。

1.2.4注意事项：血清标本必须彻底凝固，并在离心沉淀后绝不能含有任何颗粒或残存的纤维蛋白。

脂血样本或冷冻样本如果在融化后已变得浑浊不清，则必须在测试前通过离心沉淀加以澄清（在约tjl5 000g下10min）。

随机和定时采集的尿是测试尿中IgG的合适标本。

禁止使用经冷冻储存的尿和脑脊液样品。