酶的分离纯化

分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。

下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。

1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。

在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。

为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。

通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。

2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。

在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。

例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。

亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。

3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。

这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。

在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。

酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。

通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。

4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。

在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。

根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。

电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。

5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。

在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。

较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。

综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。

选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。

常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。

第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。

一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。

一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。

常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。

二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。

2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。

一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。

1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。

常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。

此法在实验宝和生产规模均可采用。

通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。

物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。

即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。

酶主要的分离纯化方法。

1、根据酶分子大小和形状的分离方法。

(1)离心分离。

许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。

包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。

(2)凝胶过滤。

酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。

这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。

(3)透析与超滤。

通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。

2、根据酶分子电荷性质的分离方法。

(1)离子交换层析。

根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。

(2)层析聚焦。

层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。

(3)电泳。

在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。

酶的分离纯化提取原则a. 相似相溶。

酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。

一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。

酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。

b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。

酶的提取方法酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。

其中以硫酸铵最为常用。

在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。

主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。

溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。

在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。

每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。

不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。

3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。

酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。

酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。