酶的分离纯化讲解

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。

关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。

•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。

的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。

3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。

在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。

4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。

对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。

细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。

酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。

抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。

低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。

常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。

分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。

下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。

1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。

在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。

为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。

通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。

2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。

在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。

例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。

亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。

3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。

这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。

在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。

酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。

通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。

4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。

在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。

根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。

电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。

5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。

在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。

较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。

综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。

选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。

常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。

酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。

这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。

2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。

常用的方法包括沉淀、沉降和离心。

例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。

3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。

4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。

树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。

5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。

配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。

酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。

6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。

通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。

7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。

通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。

8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。

以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。

第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。

一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。

一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。

常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。

二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。

2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。

一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。

1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。

常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。

此法在实验宝和生产规模均可采用。

通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。

物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。

即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。

酶主要的分离纯化方法。

1、根据酶分子大小和形状的分离方法。

(1)离心分离。

许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。

包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。

(2)凝胶过滤。

酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。

这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。

(3)透析与超滤。

通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。

超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。

2、根据酶分子电荷性质的分离方法。

(1)离子交换层析。

根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。

(2)层析聚焦。

层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。

(3)电泳。

在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。