科技广场２０１２．１２
０引言
在人抗兔多克隆抗体生产性制备中，兔的选择是极其重要的环节。随着普通级实验兔养殖费用不断攀升及供求矛盾的日益突出，在保证人抗兔多克隆抗体质量和数量的前提下，为了节省有限的普通级实验兔资源同时降低生产成本，选择家兔作为诱发载体的可行性研究具有实际意义。目前针对这个问题的研究文献较少。本研究利用合成多肽采取同样条件对普通级实验兔和家兔进行免疫，对获得的相应抗体质量和数量进行对比研究，探讨家兔作为诱发载体的可行性。
１材料和方法
1.1用兔和分组
动物分成两组：U组（普通级实验兔）和T组（家兔），每组30只，均采用同样的饲养方式和免疫方式。U组由南昌龙平兔业有限公司（生产许可证：
生产性制备多克隆抗体诱发载体选择家兔的可行性研究ＦｅａｓｉｂｉｌｉｔｙＳｔｕｄｙｏｆＳｅｌｅｃｔＲａｂｂｉｔｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＩｎｄｕｃｅｄＣａｒｒｉｅｒ
颜瑞巧１周师洁２江洪涛２吴萍２孙红斌１李卫东２
Yan Ruiqiao Zhou Shijie Jiang Hongtao Wu Ping Sun Hongbin Li Weidong （1.九江学院附属医院，江西九江332000；2.江西省系统生物医学重点实验室（九江学院），
江西九江332000）
（1.Jiujiang University Hospital，Jiangxi Juijiang332000；2.Key Laboratory of Jiangxi Province for System
Bio-medicine（Jiujiang University），Jiangxi Jiujiang332000）
摘要：目的：探讨在生产性制备多克隆抗体使用家兔的可行性，为替代普通级实验兔提供依据。方法：采用普通级实验兔与家兔在免疫前血清背景，诱发抗体数量和质量进行对比研究。结果：实验兔和家兔血清背景检测无明显差异，三次免疫后抗体效价无明显差异，兔单位体重诱发抗体冻干物重量无差异。结论：在生产性制备兔多克隆抗体中选择家兔部分替代普通级实验兔是可行的。
关键词：生产性制备多克隆抗体诱发载体；家兔；普通级实验用兔
中图分类号：R-332文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0214-03
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Objective：To investigate the feasibility of domestic rabbits,as a substitute for general experimental rabbits,as production preparation polyclonal antibody induced carriers.Methods：To observe the difference of serum background before immune,the quality and quantity of induced antibody between domestic rabbits and gen-eral experimental rabbits.Result：There is no significant difference of serum background,antibody tilter after third immune and the weight of lyophilized extracts of induced antibody per unit of body weight between domestic rab-bits and general experimental rabbits.Conclusion：It is a practicable means that domestic rabbits can partly replace general experimental rabbits as production preparation polyclonal antibody induced carriers.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Production Preparation Polyclonal Antibody Induced Carriers；General Domestic Rabbits；Experi-mental Rabbits
★江西省教育厅重点项目（编号：赣科技字〔2006〕
303）
２１４
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。 多克隆抗体的制备步骤 一、器材 剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。 二、试剂 生理盐水(或PBS) 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA) 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3 三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 四、兔子的选择 兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。 五、免疫 用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。 免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。 六、取血： 免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。 前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。 最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下： 1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。 2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。 3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。 4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。 5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。 6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
多克隆抗体制备 多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。【晶莱生物】 具体实验步骤如下： 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血. 预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。 3.效价检测 3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清 3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。 3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。 3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。 3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
?研究原著?文章编号：$%%&’(&)(*5%%$4%5’$77’%)兔抗人ERA多克隆抗体的纯化 万亚坤$85，张俊杰$，陈南春$，陈苏民$% *$第四军医大学生化与分子生物学教研室，陕西西安&$%%)565西北农林科技大学生命科学院，陕西杨凌&$5$%%4 关键词：人9:;；多克隆抗体；纯化 中图分类号：:)<5=))文献标识码：; 摘要>目的纯化兔抗人9:;的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中，表达重组/?@’A9BC融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和"2D-B0E-$5凝胶柱过滤纯化。将纯化的/?@’A9BC偶联于#F"’CGHIJCH-K"-DACB0E-L/上，制备亲和层析柱，纯化兔抗人9:;多克隆抗体。结果!表达、纯化的/?@’A9BC，相对分子质量*/B4为&(M$%)，其纯度为
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
兔多克隆抗体的制备 一、兔多克隆抗体 1.多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。 2.兔多克隆抗体的优点 1.制备体系成熟。 2.抗兔二抗产品丰富，商业化好，适合检测。 3.制备成本相对低廉。 3.为何选择兔子 4.一般流程
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。 二、兔多克隆抗体制备流程 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血. 预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
单克隆抗体研制最详细步骤 作者：时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷浏览评论 1、单抗的标记 目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。 （1）酶标记 A、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： a. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 c. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 d. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。 e. 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。 f. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。 g. 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD403×0.4 IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62 克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。 h. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： 1. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。 2. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。 3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。 4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。 5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。 6. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
实验二多克隆抗体的制备 实验目的和要求： 1、掌握多克隆抗体制备方法 2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定 实验内容： 1、猪链球菌（ 2、7、9型）分型血清制备 2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定 实验方法和步骤： （一）相关免疫血清的制备 2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体 1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组 2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免 3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL 5、分离血清之后，-20℃保存备用 （二）琼脂扩散实验： 材料和试剂 1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液 巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。 2、1%预复琼脂（或琼脂糖） 1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。 3、1%琼脂糖凝胶 1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。 4、抗原及相应免疫血清。 操作步骤 1．预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。 2．凝胶板的制备 溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。 3．免疫扩散及结果观察 将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。 4．免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。 （三）标本的保存 为了保存标本，可染色处理，步骤如下： 1用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。 2 浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。 3打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。 4用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。 实验结果 讨论
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
科技广场２０１２．１２ ０引言 在人抗兔多克隆抗体生产性制备中，兔的选择是极其重要的环节。随着普通级实验兔养殖费用不断攀升及供求矛盾的日益突出，在保证人抗兔多克隆抗体质量和数量的前提下，为了节省有限的普通级实验兔资源同时降低生产成本，选择家兔作为诱发载体的可行性研究具有实际意义。目前针对这个问题的研究文献较少。本研究利用合成多肽采取同样条件对普通级实验兔和家兔进行免疫，对获得的相应抗体质量和数量进行对比研究，探讨家兔作为诱发载体的可行性。 １材料和方法 1.1用兔和分组 动物分成两组：U组（普通级实验兔）和T组（家兔），每组30只，均采用同样的饲养方式和免疫方式。U组由南昌龙平兔业有限公司（生产许可证： 生产性制备多克隆抗体诱发载体选择家兔的可行性研究ＦｅａｓｉｂｉｌｉｔｙＳｔｕｄｙｏｆＳｅｌｅｃｔＲａｂｂｉｔｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＩｎｄｕｃｅｄＣａｒｒｉｅｒ 颜瑞巧１周师洁２江洪涛２吴萍２孙红斌１李卫东２ Yan Ruiqiao Zhou Shijie Jiang Hongtao Wu Ping Sun Hongbin Li Weidong （1.九江学院附属医院，江西九江332000；2.江西省系统生物医学重点实验室（九江学院）， 江西九江332000） （1.Jiujiang University Hospital，Jiangxi Juijiang332000；2.Key Laboratory of Jiangxi Province for System Bio-medicine（Jiujiang University），Jiangxi Jiujiang332000） 摘要：目的：探讨在生产性制备多克隆抗体使用家兔的可行性，为替代普通级实验兔提供依据。方法：采用普通级实验兔与家兔在免疫前血清背景，诱发抗体数量和质量进行对比研究。结果：实验兔和家兔血清背景检测无明显差异，三次免疫后抗体效价无明显差异，兔单位体重诱发抗体冻干物重量无差异。结论：在生产性制备兔多克隆抗体中选择家兔部分替代普通级实验兔是可行的。 关键词：生产性制备多克隆抗体诱发载体；家兔；普通级实验用兔 中图分类号：R-332文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0214-03 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Objective：To investigate the feasibility of domestic rabbits,as a substitute for general experimental rabbits,as production preparation polyclonal antibody induced carriers.Methods：To observe the difference of serum background before immune,the quality and quantity of induced antibody between domestic rabbits and gen-eral experimental rabbits.Result：There is no significant difference of serum background,antibody tilter after third immune and the weight of lyophilized extracts of induced antibody per unit of body weight between domestic rab-bits and general experimental rabbits.Conclusion：It is a practicable means that domestic rabbits can partly replace general experimental rabbits as production preparation polyclonal antibody induced carriers. Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Production Preparation Polyclonal Antibody Induced Carriers；General Domestic Rabbits；Experi-mental Rabbits ★江西省教育厅重点项目（编号：赣科技字〔2006〕 303） ２１４
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α' β' 血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3 ．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4 ．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为1 5 年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1 ．3R原则3R 指的是reduction（减少）、replacement（替代）和refinement（优化）。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2 ．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3 ．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4 ．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选 择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ- 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：（一）动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间）。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。