多克隆抗体的制备 实验报告

高级免疫学课程实验学生姓名王鹏学号1009系别动物科学技术学院专业基础兽医学任课教师李焕荣副教授2011年06月01日多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定实验一多克隆抗体的制备一实验目的1．加深对抗体基本知识的了解。

⒉了解多克隆抗体的制备方法。

二实验原理1.抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B细胞产生多克隆抗体。

在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。

如果抗原同免疫佐剂一同注入，佐剂将加强抗原的刺激效果，使家兔表达更多的抗体，其血清中的抗体浓度也会明显升高。

佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，本次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1混合，再与抗原溶液以1：1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。

佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用ELISA检出。

2.双向免疫扩散实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。

观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。

3.ELISA原理（免疫酶链反应吸附实验）该技术属于免疫酶技术。

酶免疫技术是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

4、抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。

在进行抗原抗体反应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。

蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在10000以上。

一般而言，相对分子质量越大，结构越复杂，免疫原性越强。

2.颈动脉放血
1）取一只接种过的大白兔固定于兔笼，耳缘静脉注射合适剂量的麻醉剂麻醉。将麻醉后的大白兔固定于兔台，用棉线固定四肢，细线固定门牙于铁柱，使颈部完全暴露。
2）用剃毛剪贴着皮肤减去颈部的毛，手术刀在颈部中央切开皮肤约3-4cm，纱布吸去多余的血液。用止血钳提拉住两边的皮毛，组织剪将切口扩大至7-8cm。分别剪开黏膜层、肌肉层，用止血钳扩大开口使之与皮肤一致，游离出颈动脉约2-3cm。
实验报告
实验名称
多克隆抗体的制备一（抗
班 级
姓 名
学 号
一、实验目的
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材
试剂：
酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂
器材：
兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
四、实验过程及步骤
1.免疫接种
1）取一只健康大白兔固定在兔笼中
2）酒精消毒大白兔皮肤后，通过皮下或皮内注射方式接种大白兔，共计注射8-10个位置，每一处约0.1ml。
3）为提高免疫血清效价，通常需要进行2-3次加强免疫，每次免疫间隔10-15天。然后再接免疫结束后的血清采集过程。

多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。

(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。

用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。

(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。

(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。

初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。

(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。

使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。

(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。

每两星期进行进一步的加强免疫。

每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。

(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。

9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。

(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。

用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。

用PBS-Tween洗6次。

(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。

四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴1h →稀释达9 亿个/毫升→无菌检查 • 2、免疫血清的制备 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应
实验十四 大肠杆菌多克隆抗体的制备与检测
一、实验目的
• 1、学习掌握多克隆抗体制备原理与方法 • 2、学习掌握凝集反应原理与方法
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原(多个抗原表位)机体诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体
2、凝集反应
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等

初次应答（primary response) ：
1. 是抗原第一次进入机体时引起的应答。 2. 特点：
①潜伏期长（1～2周） ②主要产生低亲和力的IgM类抗体 ③抗体浓度低 ④维持时间较短
再次应答（secondary response) ：
1. 是机体再次接触相同抗原时的应答。 2. 特点：
①潜伏期短，约为初次应答的一半。 ②主要产生高亲和力的IgG类抗体 ③抗体浓度高 ④维持时间长
实验四 多抗制备（加强免疫1）
第一部分 多抗制备（加强免疫1）
一、实验目的 1.掌握多克隆抗体的应答特点。 2.理解加强免疫的作用和必要性。
二、实验原理
1. 抗体产生的一般规律 体液免疫应答过程中，B细胞对抗原刺激的应答可 分为两种不同的情况，即在初次接受抗原刺激时， 机体发生初次应答（primary response) ；再次接 受相同抗原刺激，机体产生再次应答（secondary response)或称回忆应答（anamnestic response) 。
2.加强免疫的作用和必要性：
再次答，增加抗体量，增强抗体的亲和 力。
三、材料和试剂
• 试剂：伤寒杆菌O抗原应用液 • 材料：注射器、消毒棉球
四、实验方法
对基础免疫的同一只兔子进行加强免疫， 方法同基础免疫。即用注射器取伤寒杆菌O 抗原应用液1.5ml做静脉注射。

制备多克隆抗体（2 至 3 个月）实验动物：2 只大耳兔；●∙顾客方需提供抗原样品> 5 mg,纯度> 90 %.抗原经SDS-PAGE 检测。

若达不到要求的抗原顾客仍坚持启动项目，风险由顾客承担；●∙多次免疫兔子，每次测定效价（ELISA），数据最后一并提供给顾客；●∙提供最后一次免疫的抗血清20 ml，若量需要增加，收费另外增加；若需要提供免疫前的血清，需预先说明，并相应增加费用￥300，一般提供 1 至 2 ml；●∙验收方式：通过ELISA 方法进行检验；●∙验收标准：制备的多克隆抗体与客户方提供的抗原样品有特异性结合，同时抗体特异性只针对客户方提供的抗原样品做出保证；●∙如需做小鼠或其他动物的多克隆抗体，请与我们联系，收费标准另议。

●∙以上收费仅限于提供兔子抗血清。

最终提供：20 ml兔子的抗血清，效价在1：10，000以上，并给出相应的ELISA 鉴定报告。

制作及运输过程中，抗血清均在-20 ℃保存。

纯化多克隆抗体（1周）纯化方法Cat. No. 价格（人民币）多克隆抗体纯化（饱和硫酸氨法）CS0017 ￥500 / 20 ml多克隆抗体纯化（Protein G法）CS0018 ￥1,000 / 20 ml多克隆抗体纯化（抗原特异性纯化法）CS0019 按蛋白得率收费：￥2,000 / 1mg●∙利用Protein G 法纯化多克隆抗体的得率在14 mg 蛋白/ 1 ml 抗血清的水平;●∙利用亲和纯化法纯化多克隆抗体的得率在25 mg 蛋白/ 20 ml 抗血清的水平；●∙选择抗原特异性纯化法的顾客，每纯化20 ml 的抗体，需提供10 mg 抗原。

一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。

二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。

抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。

根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。

本实验主要制备多克隆抗体。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。

2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。

3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。

注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。

4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。

5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。

6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。

五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。

2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。

六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。

七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。

2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。

本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。

3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。

4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。

摇匀 置 37℃ ℃ 水浴 箱内 15~3 0min
全溶 全溶 全溶 全溶 全溶 大半溶 全不溶
ห้องสมุดไป่ตู้
注意事项： 注意事项： 1.抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确 2.补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜
作业：计算本组的溶血素单位。 作业：计算本组的溶血素单位。
实验二 多克隆抗体的制备
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目的： 目的：掌握溶血素的制备和溶血素单位滴定 的原理和方法。 的原理和方法。 原理：绵羊红细胞（ 原理：绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔后可以 ） 产生抗SRBC的抗体，该抗体能与 的抗体， 结合， 产生抗 的抗体 该抗体能与SRBC结合， 结合 在补体参与下，能使SRBC溶解，此抗体也称 溶解， 在补体参与下，能使 溶解 溶血素， 溶血素，常用于补体结合及补体活性测定等 实验。 实验。
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实验器材： 实验器材： 1.器具： 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、小 器具： 器具 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、 试管、滴管、注射器。 试管、滴管、注射器。 2.材料：家兔、全羊血、20%羊红细胞悬 材料：家兔、全羊血、 材料 羊红细胞悬 液。
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实验方法
1.溶血素的制备 溶血素的制备
最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。 最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。如果达 3d 5000以上时 可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃ 以上时， 4℃保存 到1：5000以上时，可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃保存
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2.溶血素单位滴定法 溶血素单位滴定法
注射日期 1 3 5 7 9 12 15 注射途径 皮内 皮内 皮内 皮内 皮内 静脉 静脉 注射剂量 全羊血0.5ml 全羊血 全羊血1.0ml 全羊血 全羊血1.5ml 全羊血 全羊血2.0ml 全羊血 全羊血2.5ml 全羊血 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞

实验一 多克隆抗体制备
微生物与免疫教研室 周芳美
一、实验目的

掌握多抗制备的原理和过程 熟悉常用的佐剂 掌握福氏完全佐剂的作用机理和制备方法 掌握研磨法和注射器法制备免疫乳剂，掌握 制备成功的判别标准 掌握动物的免疫方法


二、实验原理

抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B
细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合 成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、 具有免疫功能的球蛋白。


抗原

不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，
这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、
化学活性基团、立体结构、物理形状和弥 散速度等

本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL （至少有2mg，如量不够则用牛血清白蛋 白），用生理盐水溶解。
抗原剂量的选择

抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类，免疫 次数，注射途径，以及受体动物的种类，免 疫周期及所要求的抗体特性等而不同。
2-4周
第一次加强免疫
2-3周
第二次加强免疫
7天
效价测定
第一次免疫（基础免疫）
免疫乳剂的制备 ①研磨法: 取1.2ml佐剂加入到无菌的研钵中，缓慢加 入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴 研磨至小滴消失，边加边往同一个方向研磨， 抗原全部加入后继续研磨至乳白色粘稠的油 包水乳剂。

①研磨法


本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研 钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。 注意事项：
⑴每加一滴应研磨至小滴消失，滴加速度要 慢
⑵边加边往同一方向研磨，否则不易制成乳 白色粘稠的油包水乳剂，免疫效果就差。
剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激 剂量过高，有可能造成耐受

多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。

表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。

沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。

超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。

超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。

将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。

凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。

将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。

反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。

取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。

纯化蛋白置于4℃短暂保存。

2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。

更换复性液，4℃作用2h。

再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。

CHIKVNSP1蛋白鼠源多克隆抗体的制备一：实验目的制备针对CHIKVNSP1的鼠源多克隆抗体二：实验材料1.pET28a-CHIKV-NSP1的Rossata菌株2．IPTG,超声裂解液，蛋白纯化试剂等三：实验动物小鼠四：实验技术路线1．诱导NSP1蛋白表达，并对目的蛋白进行纯化；2．将纯化后的CHIKVC蛋白免疫小鼠；3．免疫后收集血清，利用western-blot检测能否与天然病毒蛋白NSP1结合；五：实验方法1.进行CHIKV- NSP1蛋白诱导表达用5ml kan抗性LB培养基复苏Rossata菌株，37℃，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时，转接入30mlkan抗性LB培养基中。

37℃，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时按终浓度为0.8mM的浓度加入IPTG进行诱导表达，16℃，220转分，诱导12小时。

配制：超声裂解液（1L）50mM Tris（PH7.4）+150 mM NaCl+2 mM EDTA+0.1% Triton X-100Tris-base: m=CMV=50×10-3×121.14×1=6.057gNaCl: m=CMV=150×10-3×58.44×1=8.766gEDTA: m=CMV=2×10-3×372.2×1=0.7444gTris-base、NaCl和EDTA加入900ml ddH2O溶解后，用HCl调节PH为7.4，最后补足至1L。

将诱导后的细菌，4000转分，4℃离心15分钟，收集菌体。

获得的菌体沉淀用4℃预冷的PBS（PH 7.4）洗涤3次，每次4000转分，4℃离心15分钟。

洗涤后的菌体，按原始培养体积110的比例加入超声裂解液，冰浴超声破碎细胞（工作时间2秒，暂停时间5秒，功率400W，工作次数198次）。

超声裂解后的菌体，12000转分，4℃离心15分钟，分别收集上清液和沉淀，加入SDS-PAGE上样缓冲液处理后电泳，确定目的蛋白表达的形式（可溶性表达或者包涵体形式表达），纯化目的蛋白。

多克隆抗体制备综合性实验实验原理：抗体是在抗原刺激机体免疫系统后，活化的B淋巴细胞针对抗原决定簇产生抗体，由一个B细胞细胞克隆针对某一抗原决定簇产生的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。

若由多抗原决定簇刺激机体，相应活化多个B细胞克隆，产生多种McAb的混合物，称之为多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）。

抗体的制备包括抗原的制备和纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。

许多免疫学诊断都以抗原抗体反应为基础。

实验操作：1.抗原的制备（第一周）用抗原刺激机体可使机体产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得抗体的特异性和效价。

为了提高抗原的免疫原性以获得高水平的抗体，一般需在可溶性抗原中加入佐剂。

本实验抗原为混合人全血清（20份血清混合）。

以下步骤需无菌操作（1）混合20份人全血清。

（2）取混合人全血清，用生理盐水1:4稀释。

（3）将稀释血清按与完全佐剂1:1体积的比例混匀，制成油包水状态。

将佐剂5 ml置磁力搅拌器上，边搅拌边滴加抗原，继续搅拌使其完全乳化。

将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化。

乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果。

完全乳化标准：(1) 取1滴至冰水表面，若乳剂稳定，在冰水表面不会扩散。

(2) 振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。

2.基础免疫(1) 固定家兔(2) 剪去家兔颈背部、大腿、足底的毛，碘酒和酒精棉球消毒。

(3) 免疫方法可采用背部多点注射法。

即于家兔脊柱两旁、大腿、足掌选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，每只家兔共注射1ml。

间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。

抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。

捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中。

泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。

抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。

材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。

如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。

效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

羊毛脂+液体石蜡 弗氏完全佐剂
羊毛脂+液体石蜡+卡介苗 首次免疫用完全佐剂，再次免疫用不完全佐剂。 羊毛脂、液体石蜡：油包水乳液，增加滞留时间。 卡介苗：增强免疫系统敏感性。提升抗原递呈能
力。
9
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多克隆抗体的分离与纯化
抗血清的制备： 取血，离心
亲和层析纯化： ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。 抗原亲和纯化，特异抗体。
抗体的产生及功能
抗体的产生： B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。
抗体的免疫学功能： 识别病原菌表面抗原 阻止病原菌侵袭体细胞 介导特异性免疫攻击
3
抗体的科研应用
免疫沉淀 免疫共沉淀 免疫印迹 免疫荧光染色 流式细胞术
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抗体的临床应用
检测待测抗原 妊娠检测 血型鉴定 病原菌鉴定
2018/3/19
JLU
免疫学实验-多克隆抗体的制备
吉林大学 生命科学学院 生物实验教学示范中心 王飞 fei@
内容提要
1
抗体的产生及免疫功能
2
抗体的临床及科研应用
3
抗体制备原理
4
ELISA法测定抗体效价
5
实验项目简介
1
2018/3/19
免疫系统概述
Immune system：protect against disease Major target: detect and distinguish pathogens
4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation

第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。

二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。

多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。

四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。

2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。

3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。

4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。

5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。

五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。

2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。

多克隆抗体的制备实验报告实验二多克隆抗体的制备实验目的和要求：1、掌握多克隆抗体制备方法2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定实验内容：1、猪链球菌（2、7、9型）分型血清制备2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定实验方法和步骤：（一）相关免疫血清的制备2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL5、分离血清之后，-20℃保存备用（二）琼脂扩散实验：材料和试剂1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。

2、1%预复琼脂（或琼脂糖）1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。

3、1%琼脂糖凝胶1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。

4、抗原及相应免疫血清。

1．预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。

2．凝胶板的制备溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。

3．免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。

待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。