兔多克隆抗体的制备(2020)

本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==兔多抗制备步骤篇一：制备兔多抗兔多抗的制备一．免疫动物实验动物：兔，大耳白，雌雄均可，6个月龄以上，2.5kg左右抗原剂量：首次200?g，以后1mg左右（或0.5mg/kg体重）每次200?g，3-4次即可（吴萌方案） 1颈背部皮下○2耳根后部皮下○3脚掌皮下○4后腿肌肉注射免疫途径：○免疫计划：初免与二免间隔2周，二免与三免间隔至少3周，二免后7-10天测效价。

1颈动脉放血，可得80ml ○2心脏采血采血方式：○二．颈动脉放血（一）器具1、手术刀1把2、手术剪2把3、眼科剪2把4、手术镊2把5、眼科镊2把6、止血钳2直4弯7、手术线8、血管插管9、玻璃容器 10、烧杯（内盛有水） 11、玻璃分针 12、固定架（二）药品1、2％普鲁卡因2、肾上腺素1mg/ml，1支3、酒精棉球三．步骤1．将动物仰面固定于动物固定架上，头部放低，暴露颈部。

2．沿颈部中线用2％普鲁卡因局部麻醉，15min后剪开颈中部皮肤10cm长，沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。

3．轻轻分开胸锁乳突肌，在肌束下面靠近气管两侧，即见淡红色搏动的颈动脉，将两侧颈动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入2根丝线，1根在远心端，1根在近心端。

4. 腹腔内注射肾上腺素1mg/ml 1支，以升高血压加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集，影响取血量。

5. 先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在向心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。

用眼科剪在二侧丝线中间的动脉壁上剪开一小口，以便插入塑料放血管，再以向心端丝线固定，避免放血管从动脉内滑出。

6. 轻轻松开止血钳，使血液很快射入玻璃容器，直至血液缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量。

多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。

多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。

制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。

一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。

抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。

选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。

抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。

二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。

在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。

还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。

三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。

首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。

在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。

免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。

四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。

五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。

之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。

六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。

最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。

多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。

(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。

用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。

(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。

(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。

初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。

(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。

使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。

(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。

每两星期进行进一步的加强免疫。

每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。

(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。

9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。

(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。

用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。

用PBS-Tween洗6次。

(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。

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1. 免疫原制备。

选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。

【摘要】目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。

方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。

结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。

结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。

【关键词】半抗原流行病学和动物实验已证实，镍化合物可以致癌，以致肺癌为主。

为进一步研究Cap43在镍所特异引起肺癌者体内组织及血清中的表达水平及其特点，本实验采用硫化二亚胺(EDC)连接多肽与大分子载体蛋白的方法，使其组成完全抗原，进而免家兔制备抗Cap43多克隆抗体，为研究镍所致肺癌提供依据。

1 材料与方法1 1 材料多肽由上海生工全自动合成仪合成；EDC试剂盒(美国Pierce公司)，完全及不完全福氏佐剂(美国Sigma公司)；HRP-羊抗兔和 DAB (北京中杉金桥生物技术公司)；硝纤维素膜(NC膜)，SephadexTMG-25 脱盐柱(Amersham Biosciences,Sweden),小牛血清，牛血清白蛋白(洛阳华美公司)；loading buffer(北京碧云天生物公司)；其他试均为国产分析纯；日本大耳兔平均体重15kg(本校动物实验中心)。

1 2 方法12 1 Cap43特征性肽段的合成由上海生工合成Cap43 C末端特征性的由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复3次所组成的肽段。

总质量为10mg，合成后期经HPLC纯化，纯度>95%。

冷冻干燥4℃保存。

12 2 免疫大耳白兔制备抗Cap43抗血清 (1)正式实验之前的动物准备：取5只体重1.5kg的雄性家兔作为免疫动物，同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。

多克隆抗体的标准制备流程包括以下步骤：
1.免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。

2.免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。

3.免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性
抗体。

4.收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特
异性抗体。

5.抗体的纯化和鉴定：利用亲和层析、离子交换等方法对抗体进行纯化，并通过
蛋白质印迹、ELISA等方法对抗体进行鉴定。

6.抗体的保存：将纯化的抗体进行分装，并加入适量的防腐剂，放入-20℃的冰
箱中进行保存。

多克隆抗体的制备过程中需要注意以下几点：
1.免疫原的纯度和浓度要高，以保证产生的抗体特异性高、效价高。

2.免疫动物的种属差异会影响抗体的质量和效价，因此要选择与免疫原同种属的
动物作为免疫对象。

3.在免疫过程中要保证免疫原的质量和安全性，避免对动物造成不必要的伤害。

4.在纯化和鉴定抗体时，要选择合适的方法和试剂，以保证抗体的质量和特异性。

5.在保存抗体时要注意温度和湿度等环境因素，避免抗体失活或变质。

总之，多克隆抗体的制备是一个相对复杂的过程，需要严格按照标准流程操作，以确保抗体质量和安全性。

多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。

具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。

抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。

2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。

这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。

3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。

一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。

4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。

5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。

接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。

6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。

7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。

通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。

在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。

机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。

本技术专题介绍以成年家兔制备多克隆抗体一、实验原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

二、实验材料1. 实验动物成年兔。

2. 实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

3. 实验试剂(1) 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

(2) 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）三、实验步骤(一) 抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。

(二) 预放血轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。

按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。

结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。

取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C 放置过夜使血液凝固。

用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。

抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。

（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。

动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。

若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。

（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。

途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。

（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。

佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。

配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。

免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。

专利名称：一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法专利类型：发明专利
发明人：刘永需,柳飞,赵红,孟庆福,罗杰,庄桂玉,吴硕
申请号：CN201911116283.5
申请日：20191115
公开号：CN110746506A
公开日：
20200204
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法，该方法包括以下步骤：抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；使用上述抗原乳剂对兔进行多次注射；血清效价检测：注射后8‑10天采血，分离血清，检测其双扩效价；首次注射部位为10个，后足掌及背部皮下选取多个部位点进行注射，第二次到第五次免疫注射部位在背部皮下选取多个部位点进行注射，第六次免疫注射部位为兔耳静脉注射。

采用本发明方法，成本低，过程简单，生产抗体质量稳定，抗体生产速度快，抗体水平高，抗原用量小。

使大规模生产高质量诊断试剂原料成为可能，更好地服务于诊断行业。

申请人：青岛康大生物科技有限公司
地址：266406 山东省青岛市黄岛区张家楼镇驻地
国籍：CN
代理机构：北京律远专利代理事务所(普通合伙)
代理人：张燕
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