新生小牛血清制备

细胞培养法检测新生牛血清病毒1原理某些病毒在其敏感的宿主细胞内增殖时，可引起细胞病变，即出现细胞变圆、细胞破裂、细胞融合等现象。

细胞培养法的主要特点是：广泛的适用性、操作方法简单、成本较低并且该技术方法成熟。

主要缺点是：特异性差、敏感性较低、检测速度慢。

该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。

将Vero细胞均匀分为至少3份，分别加入以上供试品。

然后再适宜的温度条件下培养，每日进行观察，最多观察21天并记录细胞病变情况。

2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛腹泻病毒；狂犬病毒；牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒。

2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；胰蛋白酶：消化细胞。

2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室:生物安全柜(CBK一D201)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心管、注射器、吸管。

2.1.5阳性病毒将BVDV等，六种病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/mL以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。

2.2方法2.2.1非血吸附病毒检查是指利用传统的细胞培养或利用其他的对不具有动物血细胞吸附性质的病毒进行检测方法的统称。

2.2.2细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。

注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。

2.2.3供试品检测取良好单层细胞培养瓶，弃掉Vero细胞旧营养液，在方瓶中分别加入胰蛋白酶消化液0.8mL，待可见细胞面呈松散状态，弃掉胰蛋白酶消化液，方瓶中分别加入适量生长液将所有细胞都从方瓶壁上吹打下来，再轻轻吹打几次，使细胞尽量分散成单个状态。

新生牛血清生产工艺i规程新生牛血清生产工艺规程引言：新生牛血清是一种重要的生物制品，广泛应用于医药、生命科学研究等领域。

为了确保新生牛血清的质量和安全性，制定和执行严格的生产工艺规程是必不可少的。

本文将介绍新生牛血清生产工艺规程的主要内容，包括原料采集、加工处理、质量控制等方面。

一、原料采集1.1 采集源新生牛血清的采集源主要是健康、无传染病和其他疾病的新生牛。

应确保采集源的健康状况和无抗生素残留。

1.2 采集方法采集时应使用无菌器具，避免污染。

采集前应对牛进行适当的操作，如洗净乳头、消毒等。

采集的血清应立即进行初步处理，以防止细菌和病毒的污染。

二、加工处理2.1 血清分离采集的牛血应置于无菌容器中，放置一段时间以进行血清和血凝块的分离。

然后，将血清通过离心等方法分离出来。

分离后的血清应立即进行下一步处理。

2.2 过滤和杀菌分离后的血清应经过0.22μm以上的过滤器进行过滤，以去除细菌和病毒。

过滤后的血清应进行杀菌处理，以确保无菌状态。

2.3 冷冻保存经过过滤和杀菌处理的血清应立即进行冷冻保存，以保持其活性和稳定性。

三、质量控制3.1 外观检查血清应具有清澈的外观，无悬浮物和异物。

若出现混浊、沉淀或颜色变化等异常情况，应予以淘汰。

3.2 冻干率检查血清冻干率是衡量血清质量的重要指标之一。

应使用合适的方法测定冻干率，并确保符合规定的标准。

3.3 病毒和细菌检测血清应进行病毒和细菌的检测，以确保无致病性微生物的存在。

常用的检测方法包括PCR、ELISA等。

3.4 活性检测血清的活性是其应用价值的重要指标之一。

应使用合适的方法测定血清的活性，并确保符合规定的标准。

四、包装和储存4.1 包装血清应使用无菌密封包装，以确保产品的无菌性。

包装材料应符合相关的规定和标准。

4.2 标签和说明书包装上应标明产品名称、规格、批号、生产日期、保质期等信息，并附上使用说明书。

4.3 储存条件血清应储存在低温、干燥、避光的条件下。

牛血清生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准用于生物制品生产的牛血清应为从出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血分离血清，经除菌过滤制成。

主要用于细胞培养。

【性状】为淡黄色澄清稍黏稠的液体，无溶血或异物。

【无菌检验】按附录页进行检验，应无菌生长。

【支原体检验】按附录页进行检验，应无支原体生长。

【外源病毒检验】将被检血清按10%浓度加入MEM培养基中，接种48孔细胞培养板培养的VERO、BHK21、PK15、牛睾丸细胞单层，每种细胞接种8孔，同时设立牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）对照各2孔，37℃培养5日，观察细胞病变，细胞均不得出现细胞病变。

培养至第5日时，对每种细胞的2孔及病毒对照孔，用PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮0.5ml，4℃以下固定30分钟，弃丙酮后自然干燥，每孔加入BVDV荧光抗体染色0.3ml，室温染色30分钟，弃荧光抗体并用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察，被检血清孔不得出现荧光染色。

剩余的6个细胞孔,前3孔，每孔加入0.2%豚鼠、人O型、鸡红细胞等量混合液0.3 ml，2～8℃作用30分钟，另3孔同样加入红细胞后室温作用30分钟。

倒置显微镜观察，均不得出现红细胞吸附现象。

【特异性抗体测定】生产企业应根据血清的使用对象确定测定的抗体种类，测定方法采用中和抗体测定法，如有适用的的ELISA方法，也可采用。

如用于生产口蹄疫疫苗的血清不得含有口蹄疫病毒抗体，用于生产猪瘟疫苗的血清不得含有BVDV抗体等。

【细菌内毒素测定】用凝胶法或细菌内毒素检测仪测定，按照鲎试剂或内毒素检测仪操作程序测定，每毫升血清的内毒素含量应低于10 EU。

【细胞增殖试验】取生长良好的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，弃营养液，用无血清MEM配成每毫升30万～50万细胞悬液，计数细胞后，用无血清MEM在96孔细胞板上作1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每稀释度加8孔，每孔0.1ml，每孔再分别补加0.1ml含20%标准血清或20%被检血清MEM营养液，置5％CO2培养箱37℃培养至48小时，倒置显微镜下计数，取每孔克隆数均在30～50之间的稀释度的8个孔，求和计为总克隆数。

新生牛血清原理
新生牛血清是指从出生不超过一周的小牛体内提取的血清。

与成年牛血清相比，新生牛血清含有更多的生长因子、抗体和其他免疫分子，因此在生命科学研究中被广泛使用。

新生牛血清的原理是通过收集小牛出生后不久的血液，待血液凝固后离心分离出血清。

由于小牛的免疫系统仍在发育阶段，新生牛血清中含有更多的免疫分子，可以用于细胞培养、细胞增殖、病毒培养、抗体生产等多种应用。

新生牛血清的使用需要严格遵守生物安全规范，并确保来自健康的牛只。

同时，在使用过程中需要注意新生牛血清的保存和运输条件，以确保其免疫活性和生长因子等活性成分的完整性。

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新生犊牛血清生产工艺验证方案文件类别：技术方案制定、批准正文1.目的为了确认新生牛血清生产工艺是否符合质量牛血清标准，特制定本方案以验证目前的生产工艺的可行性和稳定性。

2.范围和责任2.1.范围：适用于牛血清生产工艺的确认。

22 责任1. 2.1. 验证委员会：负责验证方案的审批；验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施；验证数据及结果的审核；负责验证报告的审批；222.生产管理部：负责本验证方案、报告的起草与实施，并做好相应的记录；在验证过程中对验证相关SoP进行确认。

223.质量管理部：负责验证过程中的组织协调，并对验证过程的偏差处理进行审核；224.质量管理部经理：批准验证文件。

3.人员确定确定参与本次验证的人员并要求所有参与人员签名确认。

5.设备/系统描述牛血清生产工艺分为初制血清的生产和精制血清的生产。

初制血清由基地采集出生14小时以下新生牛的血液，经大容量低温离心机300OrPm离心后、分离血清等步骤获得。

初制血清经检验合格后再通过混合、过滤除菌、分装、压塞、帖签包装而获得精制血清。

血清生产过程复杂，环节较多，厂房设施、空调系统、水系统均应符合生产工艺的需要。

过滤系统、高压灭菌设备达到灭菌标准。

所以本验证是在厂房设施验证、空调系统安装运行验证、工艺用水验证、设备验证、设备清洗验证、无菌生产验证已完成的基础上进行。

6.风险因素分析详见《纯化水系统部件关键性评估报告》7.参考文件7.12010版《中国药典7.22010版《药品生产质量管理规范》8.内容8.1文件检查确认8.1.1目的：确认文件资料已经完备，并且是当前最新版本。

8.1.2测试方法：检查最新版本的文件，现场不能出现旧文件。

8.1.3可接受标准：文件资料已经完备，并且是最终批准版本。

8.1.4记录：见附件18∙2培训检查确认8.2.1目的：确认参与验证的人员都经过此方案的培训8.2.2测试方法：检查培训记录8.2.3可接受标准：验证执行前，参与验证的人员已进行此方案的培训。