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作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的研制(全文)AXX：1672979X(2021)07001106目前多数微生态活菌制剂存在以下两个亟待解决的问题：制剂经口服时，活菌因不耐胃酸、胆汁和消化酶等的作用而极易失活；双歧杆菌等厌氧菌易受外界环境因素(如氧气、温度)的影响[2]，常温下货架寿命短，要求在低温下保存销售，因而影响了此类产品的生产、销售和应用。
目前微胶囊技术是保护菌体活力最有效和有用的方法，该技术是利用天然或合成的高分子材料，将固体、液体甚至是气体的微小颗粒包裹在直径从小于1μm至5000μm的半透性或密封囊膜的微型胶囊内[1]。
由于微胶囊内的物质与外界隔离，可免受外界不利环境的影响，若采纳肠溶性囊材，还可幸免口服时胃液的破坏[3]。
空气悬浮法(又称流化床法)制备微胶囊，是将固体囊心物悬浮于由流化床产生的承载气流中，呈沸腾状。
囊液由喷嘴喷出，雾化形成微液滴，在囊室与悬浮的囊心物相遇，液滴在囊心物表面铺展并相互结合。
由于气体的不断流动，溶解囊材的有机溶剂迅速挥发，聚合物在囊心物表面形成囊衣。
被包囊的颗粒随气流在囊室循环，完成包囊与固化过程[4]。
本研究将空气悬浮微胶囊技术应用于微生态制剂，将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保护剂和双歧因子包封于肠溶囊膜内，制成长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌制剂，以期提高口服时的菌体存活率和常温下的保存期。
1材料1.1菌种长双歧杆菌(Bifitdobacteriumlongum，简称BL，CICC6068)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，简称LA，CICC6005)：购自ZG工业微生物菌种保藏中心。
1.2培养基长双歧杆菌：大豆蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉1.0g，葡萄糖1.0g，低聚木糖0.5g，无机盐溶液4mL，蒸馏水100mL，盐酸半胱氨酸0.05g(培养基热沸后加入)，调pH7.0，121℃灭菌15min。
固体斜面加琼脂1.5～2.0g。
长双歧杆菌22-5胞外多糖(EPS)合成条件的优化
欧阳清波;李平兰
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2005(033)002
【摘要】针对筛选出的产胞外多糖优良菌株长双歧杆菌22-5,采用单因素及正交试验,对其培养基组分及培养条件进行优化,确定生产EPS的最适培养基组成为蔗糖20 g,大豆蛋白胨10 g,MnSO4为5 g,牛肉膏10 g,乙酸钠5 g,柠檬酸铵2
g,K2HPO4为2g,MgSO4·7H2O为058 g,吐温80为1 mL,蒸馏水1000 mL;最适培养条件为初始pH值为5.0,20℃厌氧培养20 h.优化后菌株22-5EPS的产量可提高到1000 mg/L,是为优化前的3倍.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】欧阳清波;李平兰
【作者单位】中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083
【正文语种】中文
【中图分类】TQ93.335
【相关文献】
1.双歧杆菌22-5胞外多糖(EPS)的分离、纯化及纯度鉴定 [J], 欧阳清波;李平兰;李伟欣;孙成虎
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厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离及其免疫、抑瘤活性的研究的开题报告一、研究背景与意义长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）是人体肠道中的一种重要益生菌，具有显著的益生作用，能够维持肠道菌群平衡，促进食物消化吸收，增强免疫力等。
近年来，人们越来越关注长双歧杆菌的生物活性成分，尤其是其细胞壁成分。
长双歧杆菌细胞壁包括完整肽、聚糖、脂类和其他辅助成分，其中完整肽和聚糖是最重要的成分。
完整肽和聚糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性，因此被广泛用于保健品、药品和食品等领域。
然而，目前对长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的研究还比较少，尤其是其免疫和抑瘤活性的研究还不够深入。
因此，本研究旨在分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，并探究其免疫和抑瘤活性，为其应用于保健、药用和食品等领域提供科学依据。
二、研究内容和方法（一）分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖采用酶解法和超声波法共同分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，首先用胰蛋白酶、细胞酪蛋白酶等酶对细胞壁进行预处理，然后利用超声波破碎细胞壁，最后通过分级沉淀、凝胶层析和离子交换层析等步骤分离纯化完整肽和聚糖。
（二）免疫活性研究采用小鼠免疫增强实验和脾淋巴细胞增殖实验探究长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的免疫活性，观察其对小鼠克隆增殖、巨噬细胞活性、淋巴细胞增殖及免疫球蛋白（IgG、IgA）等的影响。
（三）抑瘤活性研究采用小鼠肝癌模型和人肝癌细胞系HepG2进行体内和体外实验，研究长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的抑瘤活性，观察其对肝癌生长、肿瘤体积及肝功能等的影响。
三、预期成果与意义预计通过本研究，可以分离纯化长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，探究其免疫和抑瘤活性。
同时，对长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的检测方法、生物学活性机制等方面也将进行深入探究，为其应用于保健、药用和食品等领域提供科学依据。
本文的意义在于为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）及其细胞壁完整肽聚糖的生物学性状深入了解，为其在药品、保健品和食品领域的研究和开发提供有益的参考依据。
人源长双歧杆菌长亚种i772的分离、鉴定及特性研究
张栋;冯丽莉;荀一萍;薛玉玲;宁一冰;王世杰
【期刊名称】《中国食品学报》
【年(卷),期】2024(24)1
【摘要】分离人源双歧杆菌,对其进行鉴定及特性研究。
从健康婴儿粪便中分离得到1株疑似双歧杆菌,对其进行鉴定,分析其益生菌特性和发酵特性。
结果显示:1株分离自婴儿粪便样品的菌株被鉴定为长双歧杆菌,命名为长双歧杆菌长亚种i772,研究发现其对25种抗生素敏感;在人工模拟消化液试验中存活率为3.22%;在体外干预THP-1细胞试验中其使促炎免疫因子IL-8、TNF-α和TLR4分别比对照组提高了12.71,5.71,12.56倍。
在发酵乳制备试验中,在不影响整体喜好度的前提下,添加长双歧杆菌i772显著(P<0.05)提高了发酵乳的黏度和黏聚性。
结论:人源长双歧杆菌i772具有耐受人工胃肠液,调节免疫的特点,适于作为益生菌添加于发酵乳中。
【总页数】8页(P102-109)
【作者】张栋;冯丽莉;荀一萍;薛玉玲;宁一冰;王世杰
【作者单位】君乐宝乳业集团股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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