土壤中霉菌的分离

Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。

3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。

b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。

微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。

前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。

3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。

刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。

从土壤中分离霉菌的方法咱得先准备好东西呢。

你得有土样，就从你家院子里或者附近小花园挖点土就行。

然后呢，还得有培养基，这就像是霉菌的小餐桌，让它们能在上面生长。

像马丁氏培养基就挺不错的。

还有一些小工具，像无菌水、接种环之类的。

有了这些东西，就开始操作啦。

把土样取来之后，咱得把它放到无菌水里面。

这就像是给土样洗个澡，让里面的霉菌能和土分开点。

你就想象那些霉菌在水里自由自在地游着，不过是微观世界里的小游动啦。

接着呢，要把这个含有土样的无菌水进行稀释。

为啥要稀释呢？因为如果不稀释，那霉菌太多了，都挤在一起，咱就不好区分它们啦。

就像一群人挤在一个小房间里，你都分不清谁是谁，稀释了就像是把他们分散到不同的小房间，看得清楚多啦。

然后把稀释后的溶液，用接种环取一点，放到培养基上。

这就像是把小霉菌们送到它们的新家里。

之后把培养基放到合适的环境里，一般霉菌喜欢温暖又有点潮湿的地方。

就像我们人喜欢住在舒服的房子里一样，霉菌也得有个适宜的环境才能茁壮成长呢。

过几天之后呀，你就会看到培养基上长出各种各样的东西啦。

霉菌呢，一般是毛茸茸的，有各种颜色，像白色、绿色之类的。

这时候你就可以仔细观察啦，看看哪些是你想要的霉菌。

不过宝子们要注意哦，在整个过程中一定要保持无菌的操作。

就像我们在做一件超级精致的手工一样，不能让别的细菌之类的混进来捣乱。

要是不小心混进来了，那就像是一场小派对来了不速之客，会把整个事情搞得乱糟糟的。

从土壤中分离霉菌就是这么个有趣的过程，虽然有点小复杂，但只要你细心一点，就可以成功啦。

等你真的分离出霉菌的时候，那种成就感就像你自己做出了一道超级美味的菜肴一样棒呢。

霉菌的分离实验报告引言霉菌是一类真菌，广泛存在于自然界的土壤、空气、植物等环境中。

它们以分解有机物质为生，在自然界中具有重要的生态作用。

然而，霉菌也是一种常见的病原微生物，能够引起多种人类和动植物的感染疾病。

为了更好地了解霉菌的特性和传播途径，本实验旨在通过分离方法获取纯净的霉菌菌株，并初步分析其形态特征。

实验材料和方法实验材料：- 手套- 剪刀- 无菌培养基（琼脂）- 玻璃棒- 离心管- 蒸馏水- Petri 洁净培养皿- 测量瓶实验方法：1. 霉菌样品的收集：在潮湿的环境中选择具有明显霉斑的表面进行采样，避免采集到周围环境中的杂菌。

2. 实验场所的准备：在无菌条件下完成所有操作，保持实验环境的卫生。

3. 样品处理：带着手套使用剪刀将具有霉斑的样品剪下，并将其放入离心管中。

加入20 ml 的蒸馏水，将离心管盖好，摇匀样品，使其充分悬浊。

4. 稀释与分离：取0.1 ml 的上述悬浊液加入测量瓶中，再加入9.9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。

取1 ml 的稀释液加入离心管中，再加入9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。

依次取样进行稀释，最后取适量稀释液均匀涂布在无菌琼脂培养皿上。

5. 培养条件：将琼脂培养皿孵育在恒温培养箱中，温度为25 ±2，培养时间为48 - 72小时。

6. 菌落形态观察：在培养箱中取出培养皿，通过目测观察霉菌菌落的形态特征，如颜色、形状、凸起程度等。

实验结果经过培养箱中的恒温孵育，在培养皿上出现了多个菌落。

根据其形态特征，选取了三个菌落用无菌棉签分别划线后进行传代。

菌落1- 颜色：灰白色- 形状：圆形- 表面：粗糙- 边缘：光滑菌落2- 颜色：绿色- 形状：不规则- 表面：绒毛状- 边缘：锯齿状菌落3- 颜色：黑色- 形状：扁平- 表面：光滑- 边缘：光滑结论通过实验，成功分离得到了三种霉菌菌株，并对其进行了初步的形态特征分析。

菌落1为灰白色、圆形，表面粗糙，边缘光滑；菌落2为绿色、不规则形状，表面绒毛状，边缘呈锯齿状；菌落3为黑色、扁平形状，表面光滑，边缘光滑。

微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：李海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪180112010009董天涵180112010008蒋怡菲180112010018逄颖180112010035【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。

（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。

2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。

一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。

不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。

所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。

已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。

接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。

接种的关键是要严格的进行无菌操作。

鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。

（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。

目录摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化,得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌;根据菌落形态观察,革兰氏染色结果,芽孢有无及位置,运动性以及一系列的生理生化试验的结果,对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群;关键词土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养前言在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚;群落是不同种类微物的混和体;为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株;这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术;纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代;分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成;实验目的1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；3.学习测定土壤中细菌数目,种类的方法；4.根据菌落形态,染色结果,运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌;实验原理一、经典分类鉴定方法以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程,因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察,染色,生理生化试验,免疫学试验等对其进行逐步定位;二、现代分类鉴定方法1．微生物遗传型的鉴定（1） DNA碱基比例的测定 G+Cmol%以下为该方法的关键因素：解链温度法Tm值G+Cmol%值只能做否定判断；G+Cmol%值差别>5,属不同的种；差别>10,属不同的属;2 核酸分子杂交法DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性;结论：I DNA同源性≥ 60% 同种II DNA同源性≥ 70% 同亚种III DNA同源性60~ 70% 不同亚种IV DNA同源性20~ 60% 同属316s rRNA作为细菌进化的计时器本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制,主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主;实验整体思路：在确定取样环境之后,对微生物原样进行梯度稀释,产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化,用平板划线法多次划线得到纯种；对得到的纯种细菌染色并镜检,利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位;实验仪器及材料1.土样：18号土样2.试剂及培养基a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3.仪器锥形瓶500mL×2；300mL×2；100mL×3、培养皿20套、试管20支、移液管3支、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等实验步骤A.细菌的筛选,分离纯化及鉴定1.细菌的筛选a)土样处理i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水,用移液管各移取9ml于五支洁净试管,再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶,并放入少许玻璃珠,包好灭菌；ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中,充分震荡摇匀,然后放在30℃恒温培养箱中静置15min;b)果胶酶菌种筛选i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀,此为10-1稀释液,以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液如下图；ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上10-1、10-3两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿,用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述,就菌落的大小大、中,小,颜色白,黄,粉红等,干湿干、湿,边缘整齐,不整齐,表面光滑,粗糙,有无突起等分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化a)划线分离：制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火图细菌的划线分离示意图焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.细菌的基本形态及运动性鉴定a)纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上注意：点种的量不宜过多,以3～4个为宜,在30℃培养箱中培养1～2天,取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小b)简单染色步骤i.涂片取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可；注意取菌不要太多ii.干燥与固定涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准；iii.染色将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色iv.水洗倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止；v.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态;c)革兰氏染色步骤i.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水;分别取四种活跃生长期菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌按常规方法涂片不宜过厚,用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定;ii.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色后水洗；iii.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗；iv.脱色先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗；v.复染先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染后水洗；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌;分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果;d)芽孢染色步骤i.涂片,加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌;然后按照常规方法加热干燥及固定；ii.孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸；iii.水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂;具体水洗按常规方法进行；iv.复染用%番红水溶液复染2min；v.水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi.镜检先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢;e)半固体穿刺法观察细菌运动性i.配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温；ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近但勿触及试管底,然后循原路退出;如图所示：iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性;4.细菌的生理生化试验a)淀粉水解试验i.培养基制备配制淀粉培养基,灭菌后将冷却至50℃左右,无菌操作制成平板；ii.接种用记号笔将平板划成四部分,将所鉴定的菌种在不同位置点种;注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同,为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠,宜采用点种的方式,如下图;接种完成后贴好标签；iii.培养将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时;b)葡萄糖发酵试验i.培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;c)乳糖发酵试验i.培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有乳糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;d)吲哚试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;e)甲基红试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个,观察不同形态菌落的数目以及总菌落数,并记录,求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目;根据以上细菌的形态,革兰氏染色结果,芽孢的位置,运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定;B.霉菌的筛选,分离纯化及鉴定1.霉菌的筛选a)涂布配制几丁质酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却至不烫手,无菌操作加链霉素1mL/1000mL倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上100、10-2两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；b)培养将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；2.霉菌的分离纯化a)划线分离：制备几丁质酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取长出的菌种,第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以图霉菌的划线分离示意图降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)再配制一份PDA培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.小室培养法鉴定霉菌a)灭菌准备制作4个平皿,在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放一U形玻棒,其上放一洁净载玻片和四块盖玻片,盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油,加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好;b)灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min由于培养基中有葡萄糖,为防止由于高温而使糖发生糊化而变质,灭菌温度不宜过高;c)制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中,使之凝固成薄层;在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格,通过无菌操作,用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块;注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,冷却后再进行切割操作d)接种在无菌操作台上,先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上,然后用解剖刀取一小块儿琼脂块,置于载玻片上注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡,灼烧冷却后再进行下一步的操作,用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子,分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上;最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油用于保持平皿内的湿度 ,盖上皿盖并贴标签,每一种菌接种两个小室;e)恒温培养将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天;f)镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片,用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子,根据真菌手册对所得的菌进行鉴定;实验结果A.细菌部分倍稀释平板的细菌种类和数目表错误!未定义书签。

土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。

它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。

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以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。

振荡10分钟，制成10-1菌悬液。

按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。

然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。

如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。

将培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。

然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。

培养基上会出现微生物菌落。

霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。

曲霉的分离曲霉是一种真菌，广泛存在于自然界中的土壤、水体和空气中。

它们具有很强的代谢能力，可以分解有机物质，是生物降解和有机废弃物处理的重要微生物。

此外，曲霉还可以产生一些重要的代谢产物，如抗生素、酶、有机酸等，在食品工业、医药工业、环境保护等领域具有广泛应用。

曲霉的分离是研究其代谢特性和产物合成机制的基础。

以下是关于曲霉分离的详细介绍：1. 分离方法（1）土壤样品法：从自然环境中采集土壤样品，将其加入含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。

（2）空气样品法：采用空气采样器采集室内或室外空气中的微生物样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。

（3）食品样品法：从食品中采集曲霉样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。

2. 培养条件曲霉的生长和代谢需要适宜的温度、湿度和营养物质。

通常情况下，曲霉的最适生长温度为25℃-30℃，最适生长pH值为5.0-7.0。

在培养基中添加合适的碳源、氮源和矿物质元素可以促进曲霉菌株的生长和代谢。

3. 筛选方法在分离得到曲霉菌株后，需要进行筛选以获得具有特定代谢特性或产物合成能力的菌株。

常用的筛选方法包括：（1）形态学特征：通过观察菌落形态、颜色、纹理等特征来鉴定不同种类的曲霉菌株。

（2）抗生素活性：利用抑制其他微生物生长的能力来筛选具有抗生素活性的曲霉菌株。

（3）酶活性：利用曲霉产生的酶来分解特定底物，通过观察底物的降解情况来筛选具有特定酶活性的曲霉菌株。

（4）代谢产物：通过检测曲霉菌株发酵液中的代谢产物来筛选具有特定代谢能力的曲霉菌株。

4. 保存方法分离得到的曲霉菌株需要进行保存以便后续研究。

常用的保存方法包括：（1）冷冻法：将曲霉菌株培养在含有10%-20%甘油或DMSO的琼脂培养基上，将其置于-80℃低温条件下保存。

（2）干燥法：将曲霉菌株培养在琼脂培养基上，将其置于干燥器中进行干燥处理，然后将其保存在低温、低湿度条件下。

如何从土壤（污水）中分离出微生物把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。

而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。

对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用2.做浸出液的梯度稀释3 .涂平板4.划线分离5.接平板，接斜面6.检测从土壤中分离微生物环境工程（1）班一、试验目的1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。

2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。

二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。

它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。

此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。

因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。

三、实验器材(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。

(三)土壤样品、天平、称旦纸。

（四）恒温箱、气体流量计四、试验程序1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。

用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液3、涂布将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。