霉菌的分离纯化和鉴定讲解共45页文档

Ｔ ｅｒｓｌ ｈ ｗ ｄｔａ：１ｈ ｗ ｓｔｅｆｓ ｒｔａ ｅｆｔｒｐ ｐ ｒｗ ｓｄｃ ｍｐ ｓｄ ｂ ｎ ｌｃ ｔ ｉ，ｎ ｈ ｌ ｒｐ ｐ ｒ ｓ ｈ ｎ ｅ ｎｏｐｓｅｄ ｒ ｇ ｈ ｅｕｔ ｓｏ ｅ ｈｔ（） ａ ａｔ ｈ ｔｈ ｌ ａ ｅ ａ ｅｏ ｏｅ ｙｏ ｅｂａｋｓ ａｎ ａｄ ｔｅｆｔ ａ ｅ ｃ ａ ｇ ｄｉｔ ａｔ ｕ ｎ ｓ ｈ ｅ ｔ ｉｅ ｒ ｉｅ Ｗａ ｉ ｌ ｓ ｈ ｎｆ ２ｈ（ Ｃ ｎｙ ｅａｔ ｉ ，Ｐ ｎ ａ ｒｌ ｅ ｕ ｓ ｃ ｖ ｙｏ ｔｅ ｔ ｉ ｗ ｒ ｈｇ ｅ ｖ ｔ ｉ ， ａｈ ｄ２ ８ ｍ ／ Ｌ ‘０ｒ ｎ ｅ ａ ｒ１ ． ） Ｍ Ｃ ｅ ｚｍ ｃ ｖ ｙ Ｆ Ａ ａ ｄｎ ｔ ａ ｃｌ ｌ ｅａｔ ｉ ｆ ｈ ｒ ｎ ｅ ｉ ｓ ｉ ｆ ｅｓ ａ ｓｒ ｃ ｅ ． ４ ｆ ｇ ）３ ｉ， ｓｔ ｏ ２ ｉｔ ｕ ｌｏ ｉ ｔ ｓ ａ ｅ ｈ ｔ ｎｉ ｒｎ ｅ ８ ｍ ａ
文 献 标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ：０ ６ ４ １ （ ０ ０ １— １４ ０ １０ — ３ ｌ２ １ ）６０ ４ — ２
０ 引 言
表 １ 葡 萄 糖 标 准 溶 液 光 密 度测 定 结 果
纤 维 素 是 所 有植 物 的主 要 组 分 ，构成 了植 物 干 物 质 的 Ｌ ～ ／， ／２ ３ ３ 项目 空 白 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ 世 界 上 纤 维 素 的 年产 量 估 计 可 达 ４ ｌ １ｔＰｅｒ Ｂ ｇｉｅ １９ ）因 含 糖 总 量 （ ｘ ０ ０（ｉｒ ｅｕｎ ，９ ０ ， ｅ ｍ曲 Ｏ Ｏ２ ． ０４ － ０６ ． ０８ ． １０ ． １ １４ ． ２ ． １６ ． ｍＬ） ０２ ０４ － Ｏ６ ． Ｏ８ ＿ １Ｏ ． １ １４ ． ２ － １ ． ６ 而 ， 维 素是 世 界 上 最 丰 富 而 又 不 断新 生 的资 源 。 纤 有取 之不 尽 ， 之 葡 萄糖 液 （ ０ 用 不 竭 的特 点 。 而 ， 种 资 源 的 大部 分现 在 是 作 为 废 物 而被 抛 弃 掉 。 蒸 馏 水（ ２０ １８ １６ ｌ １ １Ｏ Ｏ８ ０６ ０４ 然 这 ｍＬ） ． ． ４ ＿ ． ２ ． ． ． ． ＮＳ试 剂 （ ｍＬ） １５ ． １ ． ５ １ ． ５ １５ ． １ ． ５ １５ ． １ ． ５ １ ． ５ １ ． ５ 在 自然 界 中 ， 些 “ 物 ” 通 过 纤 维 素 分 解 菌 ， 能 产 生 纤 维 素 酶 Ｄ 这 废 是 即 加 热 沸水浴中加热 ５ ｎ ｍｉ 的 微 生物 将 其 自然 分 解 的 。在 我 国纤 维 素 资 源 极 为丰 富 ， 每年 仅 农 冷 却 立 即用 流 水 冷 却 作 物秸 秆 产 量 就 高 达 ７Ｏ ｌｓ，约相 当于 我 国 北 方 草 原 年 打 草 量 的 ． Ｏｔ ｘ 定容 至 ２ ｍ ５Ｌ ５ Ｏ多 倍 ， 大部 分地 分没 有 得 到 充 分 利 用 。 在 农 村 ， 秆 主 要 用作 蒸馏水定容 绝 秸 Ｏ． Ｏ Ｏ１ ０３ ８ ０５ Ｏ７ ０９ １１ ４ ＿ｌ ．２ ．１ ．２ ．１ １３ １５ －２ ．３ 燃料、 畜禽饮料与积肥 ， 不仅利用率低 ， 还对环境造成 污染… 。因此 ， 光 密 度 （ Ｄ） 合 理 开 发 和 科 学 利 用 农 作 物 秸 秆 这 一 丰 富 的 可 再 生 资 源 是 各 国 政 零 后 ， 定 各 管 光 密度 值 ． 测 以葡 萄 糖 浓 度 为 横 坐 标 ， 密度 值 为 纵 坐 光 府 及 广 大 科 技 工 作 者 十 分 关 注 的 问题 。但 是 纤 维 素 很 难 被 分解 利 标， 得标 准 曲线 （ １ 。 图 ） 用 ， 何 将 纤 维 素 转化 为能 直 接 利 用 的资 源 和 能 源 是 摆 在 人 们 面 前 如 １ ． 纸 分解 度 的观 察 在 试 管 中加 入 酶 液 ８ｍＬ 再 加 入 ｐ ． ２滤 ６ ， Ｈ 的 一 个难 题 。 用 微 生 物 产 生 的 纤维 素酶 将 其 转 化 为人 类 所 需 的 能 利 ４４柠檬酸缓冲液 ２ｍ ， ． Ｌ 摇匀后加入滤纸条（ ｃ ｘ ｃ 和 几滴二甲 １ｍ ６ｍ） 源 、 品 和 化 工 原 料具 有重 要 的 现 实 意 义 。 年来 ， 食 近 对秸 秆 类 纤 维 素 苯 ， 于 ５℃恒 温 水 浴 中静 置 反 应 ２ 稍 加 震 动 ， 察 其 酶 活 力 置 ０ ４ｈ后 观 物 质 的利 用主 要采 用 生 物 法 ， 利 用 微 生 物 将 纤 维 素 、 纤 维 素 降 既 半 的 分解 强 度 ＋滤 纸 边缘 膨 胀 ； ＋滤 纸 整 齐膨 胀 并 下 弯 ｉ ＋ ） 纸 ｆ） （ ） ＋ ＋滤 ｆ ＋ 解 并 转 化 为茵 体 蛋 白 的方 法 。 因 此 ， 离 和 筛 选 高 酶 活 的菌 种 显 得 分 不定形 ； ＋ ＋滤纸全成糊状． 滤纸不到 ２ （ ＋） ＋ 若 ４ｈ全部分解 ， 则记下达 尤为 重 要 。 本研 究 在 广 泛 搜 集 试材 的 基 础 上 ， 分离 筛 选 到 一 株 酶 活 到 全部 被 分解 的 时 间 ． 力 高 的纤 维 素 分解 菌 。 １ ．Ｃ ． ３ ＭＣ酶 活 力 测 定 移 取 酶 液 ０５ｍＬ于 试 管 中 ， 入 含 质 ６ ． 加 １ 材 料 和 方 法 量浓 度 为 ０ ｇｃ ～Ｎ ． Ｍｃ ａ的柠檬 酸 缓 ； ５ 中液 （Ｈ ４４ ００ ｌ ）． ｐ ．、 ． ｍｏＬ１ ５ ／ ５ １１样 品来 源 样 品分别为富含纤 维素分解茵 的玉米地土壤 、 ． ｍ ， 后 在 ５ ￣水 浴 锅准 确 作 用 ３ ｉ ， 即按 Ｄ Ｓ法 测 定糖 。 Ｌ然 ０Ｃ ０ｍ ｎ后 立 Ｎ 牛粪 和 酒 糟 。 １２培养基 ① 分离平板培养基 ； ＿ ②液体培养基 。 １ ． 纸 纤 维 素 的 制 备 将 滤 纸 剪 成 １ｍ 宽 ，ｃ 长 的 滤 纸 条 。 ３滤 ｃ ６ｍ 式 中 ： 萄糖 量 — — 从 标 ； 线 上查 得 的 葡 萄糖 值 （ ｇ 葡 隹曲 ｒ ） ａ １ ． 株 的分 离 、纯 化 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 进 行 菌 种 的分 离 ４菌 １６４滤 纸糖 化 力 测 定 移 取 稀 释 酶 液 ４ｎ ．． ｒ Ｌ于试 管 中 ，加 入 柠

． 黑 曲 霉 培 养 物 ．
一
插 片 培 养 物 ．
放 线 菌 培 养 物 ： 链 霉 菌
． 放 线 菌 和 真 菌 培 养 物
三 、 实 验 材 料
碘
灯环
四
液
、、
天
、
四、实验步骤
观察放线菌气生菌丝和基内 菌丝的区别 取插片一片，直接在显微镜 下进行观察，注意分界面两 侧菌丝形态的差异 插片法培养放线菌
分离真菌的同学取一瓶马丁-孟加拉红培养基 （200ml／瓶）熔化后冷至50℃后加链霉素 2ml倒平板。
四．悬液涂布(演示): 无菌操作(从稀至浓将菌液涂布均匀)采用10 －2，10－3，10 －4稀释液涂布马丁－孟加拉红平板；采用 10－3，10－4，10－5稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板,每人用 剩下的1个平板做划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分 离（演示）
2、霉菌：
霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮 状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。
霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因 此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖 或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。
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实验三 放线菌、霉 菌的形态观察 及微生物的分离纯 化
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一、实验 目的
实验（一）放线菌、霉菌的形态 观察
观察放线菌、霉菌的形态结构特征
学习掌握霉菌染色的基本方法 基本掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉 菌菌落形态特征
二、实验原理
放线菌：放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因菌落呈放射状 而得名。 放线菌的菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。 它和细菌单染色一样，可用石炭酸复红和吕氏美蓝等染料着色后，在显微镜下观察它们的形态。放 线菌是由不同长短的纤细的菌丝所组成的单细胞菌丝体，菌丝内无隔膜，菌丝体分为两部分，即潜 入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和有营养菌丝向上生长的气生菌丝，有些气生菌丝分化成各种 孢子丝，呈螺旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮生三种。孢子的表面光滑或粗 糙，圆或椭圆和干形。孢子有各种颜色。这些形态特点都是鉴别放线菌的重要依据。

分解纤维素霉菌的分离,纯化与鉴定作者：马丹丹来源：《价值工程》2010年第16期摘要: 以滤纸纤维素为碳源,从我院青苑和南区草地的土壤中分别分离1株能分解纤维素的真菌菌株。

分别对其进行了滤纸分解度、羧甲基纤维素酶活力(CM Case)、滤纸糖化力(FPA)和天然纤维素酶活力的测定,结果表明:①一种黑色霉菌对滤纸的分解能力最强,不到12小时滤纸全成糊状;②同时羧甲基纤维素酶活力、滤纸糖化力和天然纤维素酶活力也最高,分别为2.568(mg / ml) 30 min 、0.28(mg / ml).h 和227(mg / ml).d。

Abstract: Two strains of fungi decomposing cellulose were isolated from the soil of our campus taking the filter paper cellulose as carbon resource.For these strains,the experiments of decomposition of filter paper,determinations of CMC enzyme activity,FPA and natural cellulase activity were done.The results showed that:(1)It was the faster that the filter paper was decomposed by one black strain,and the filter paper was changed into paste during less than for 12 h.(2)CM C enzyme activity,FPA and natural cellulose activity of the strain were highest in five strains,reached2.884(mg/mL)·30 min,0.36(mg/mL)·hand 2768(mg/mL)·d,respectively.关键词:纤维素酶;滤纸;酶活力;纤维素分解菌Key words: cellulase;filter paper;enzyme activity;cellulose—decomposing fungus 中图分类号:TQ352.2文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)16-0144-020引言纤维素是所有植物的主要组分,构成了植物干物质的1/3～2/3,世界上纤维素的年产量估计可达4×1010t(Pierre Beguine,1990),因而,纤维素是世界上最丰富而又不断新生的资源。

2、霉菌： 霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的 名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状 真菌统称霉菌。 霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有 分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因此，在观察是要注意 菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根， 无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样 着生的。 由于霉菌的菌丝较粗大，而且孢子容易飞散，如将 菌体置于水中容易变形，故观察时状不用水浸法制片，而 将菌体置于乳酸石炭酸棉兰染液中，使细胞不易干燥，并 有杀菌作用。
平板涂布
简单易行，但易 造成机械损伤
划线分离方式
结果分析: 1. 我所涂平板种类： （牛肉膏或马丁 氏） 2. 计数：牛肉膏平板取单菌落数目在30～300个 左右的稀释度来计数，马丁氏平板取单菌落数目 在10～100个左右的稀释度来计数 3.我所计数的平板稀释度是： 单菌落 数目： 、 、 。 4.计算：活菌数目/每克土壤＝ （计算过程）＝ 个/每克土壤 5. 对你和同伴的细菌及真菌计数结果进行分析
实验报告 从土壤中稀释分离微生物的原理、方法、步骤。 2．思考题 (1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平 板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为 什么? (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优 缺点及应用。 (4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中 在一起时，你认为问题出在哪里? (5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有 何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?
⑵气生菌丝：又称二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时期，
长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。
⑶孢子丝：当气生菌丝体发育到一定程度，其上分化出可形成

从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。

将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。

观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。

2 材料2.1 病料发了霉的红薯、酸败腐烂的苹果2.2 培养基2.2.1 沙堡琼脂培养基成分：蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.3 保存琼脂培养基成分：蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.3 器材无菌室、手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、锥形瓶、漏斗、试管、烧杯、胶头滴管、石蕊试纸、接种环、酒精灯、量筒、玻璃棒、纱布、滤纸、试管塞、报纸、扎绳、标签、温箱、冰箱、盖玻片、载玻片、显微镜、杜氏管3 方法3.1 真菌的分离培养3.1.1 实验的准备沙堡琼脂培养基的制备：用天平称取蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克，用量筒量取蒸馏水1000毫升置烧杯中混匀，在电炉上加热熔化，加热过程中不断用玻璃棒搅拌，调整PH值至5.4，倒入锥形瓶中，115℃灭菌20分钟，倾注平板，冷却[1]。

无菌室、接种箱的清洁：用酒精棉球将接种箱的内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种环、笔、火柴等实验用具放入接种箱内，密封接种箱。

依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。

3.1.2 划线分离培养：在酒精灯火焰下进行以下操作（1）从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。

细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。

2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

4. 学习平板菌落计数法。

二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。

要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。

微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。

表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。

3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。

4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。

4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。

（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

霉菌的检验原理霉菌的检验原理是通过不同的检验方法和技术来确定某种物质、环境或生物体中是否存在霉菌或其代谢产物。

霉菌检验的原理是基于不同的生物学、化学和物理学原理，通过从样品中分离出霉菌，培养和鉴定霉菌的种类和数量，从而确定样品中霉菌的存在与否。

一、样品采集和制备：霉菌检验的首要步骤是正确采集样品，并适当制备样品以便后续检验操作。

样品的采集应遵循卫生规范，避免外界污染和交叉感染。

根据不同检验需求，可以采集空气、液体、固体等样品。

样品的制备通常涉及样品的剪切、研磨、稀释等处理，以使样品更适合后续的操作。

二、分离和培养：霉菌检验的下一步是分离和培养样品中的霉菌。

通常采用平板培养法，将样品均匀涂布在培养基上，或使用液体培养法，将样品浸入培养液中。

平板培养法有利于分离霉菌并观察菌落形态和颜色，而液体培养法则适用于培养少量霉菌，并在液体中查找霉菌的产物或酶活性。

霉菌需要适宜的温度、湿度和pH值等环境条件才能生长，因此培养基的配制和培养条件的控制非常重要。

三、鉴定和分类：分离出的霉菌需要进行鉴定和分类。

鉴定的方法可以根据霉菌的形态特征、生理生化特性、代谢产物等方面进行。

常见的鉴定方法包括显微镜观察、生理生化试验、生长特性观察和分子生物学方法等。

显微镜观察可以了解霉菌的菌丝结构、孢子形态和排列方式等特征。

生理生化试验可以测试霉菌对碳源、氮源和金属离子等的利用能力。

生长特性观察可以观察霉菌在不同培养条件下的生长速率和生长模式等特点。

分子生物学方法可以通过核酸序列分析来确定霉菌的亲缘关系和分类。

四、数量测定和统计分析：除了鉴定和分类霉菌种类，还需要对霉菌的数量进行测定。

数量测定可以通过菌落计数法、测霉菌生物量、PCR方法等进行。

菌落计数法是在培养基上计数菌落的数量，根据菌落数量计算霉菌的含量。

测霉菌生物量可以通过称量或比色法进行。

PCR方法是利用特异性引物扩增霉菌的核酸片段，根据扩增的结果确定霉菌的存在与数量。

五、数据分析和结果解释：霉菌检验的结果需要进行数据分析和结果解释。

成熟的子实器官或子实体的颜色、 大小和形状。
头放射形， 顶囊球形或瓶形， 小梗一般单层。 后变绿色， 最后变为褐 F 号 在 =>? 培 养 基 上 菌 落 初 为 白 色 ， 绿色， 菌落表面呈粉粒状， 有皱褶， 反面为绿色， 靠近中心处有时有 小梗顶端生分 裂纹。 菌丝有隔， 顶囊膨大不明显， 顶囊 5 H @ 生小梗， 生孢子串。 生化试验 （结果见表 9 ） 5;9;5 分离所得菌株生理、
黑色， 球形或近球形； 假根短小、 手指状、 不发达； 厚垣孢子较多， 为 球形、 椭圆形。 菌丝稠密 ， 起初白色， 老后灰 5 号在 =>? 培养基上呈棉絮状， 褐色至黑色。孢囊梗较细长、 淡褐至黄褐色， 多数单生， 较 少 5<@ 株成束， 有时在孢囊梗上有囊状膨大。孢子囊球形或近球形， 初为 白色， 后变黑色； 假根极不发 达 ， 短指状或没有假根； 厚垣孢子多， 多为近球形。 先白色后变灰黄至褐 @ 号在 =>? 培养基上呈稠密的棉絮状 ， 灰色。 孢囊梗灰褐至暗褐色， 光滑， 孢子囊球形或椭圆 5<C 株成束。 形， 浅褐色； 囊托楔形， 大而明显 ； 假根发达， 呈根状， 褐色； 一般无 厚垣孢子， 有时有少量。 先白色后变黄白 7 号在 =>? 培养基上呈疏松至稠密的 絮 状 ， 较少单生， 有时膨大成 色至灰色。孢囊梗褐色、 光滑， 5<7 株成束， 分枝。孢子囊球形或近球形， 初为白色， 老后为褐色； 囊托楔形； 假 根有或无， 若有假根， 假根发达， 根状， 褐色， 厚垣孢子极多， 形状大 小不一致。 黄色， 菌丛矮。孢囊梗呈短的稀 C 号在 =>? 培养基上呈絮状， 疏的假轴状分枝， 产生 5<@ 个孢子囊。孢子囊黄色至黄褐色， 球形 或长圆形。孢囊孢子椭圆形、 拟椭圆形。厚垣孢子数量甚多， 大小 不一， 黄色至褐色。 平坦 ， 后中心微隆、 变黄 8 号在 =>? 培养基上菌落初为白色、 色， 再变为棕黑色， 菌落表面呈颗粒状， 有放射性凹沟、 有同心环 形， 反面为黄至秸黄色、 有放射性裂纹， 表面的凹沟与反面裂纹相 对应。菌丝有隔， 足细胞膨大不明显， 顶囊明显膨大、 多呈球形， 表 面生辐射状小梗， 小梗顶端分生孢子串生。 后变 青 黄 色 、 黄色， 接着 G 号在 =>? 培养基上菌落初为白色， 逐渐变为黄绿色、 褐绿色， 中心微隆， 表面呈颗粒状， 靠近中心处有 放射性凹沟， 有同心环形， 反面为黄色。菌丝有隔， 表面较粗糙， 足 细胞膨胀不明显， 顶囊膨大明显， 呈烧瓶形， 顶囊上长双层小梗， 孢 子囊、 梗均为褐色。 后变黄褐色， 分生孢子 B 号 在 =>? 培 养 基 上 菌 落 初 为 黄 色 ，

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。

了解微生物的分离纯化方法。

2.学习检测水中大肠菌群的方法。

3。

学习微生物的保藏及鉴定方法。

4。

熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。

48小时后仍不产气的为阴性结果。

2。

平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、实验器材及试剂1。

水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。

第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。

2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。

于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。

于121℃高温高压灭菌20分钟。

极端环境：
尽量存放在与采样环境相当的条件下至菌种分离；
植物和动物：
确保样品的完整性，迅速对植物切口进行消毒，并用石蜡封 住以防外来菌种入侵，用无菌装置带回；如动物粪便的采集应在动物 排便后马上收集其中间部分，避免外源污染，置于无菌袋内；
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二、样品的预处理
1、目的菌的富集培养
根据目的菌的生理特性，加入其所需要的营养物质及微量成分进 行诱导增殖，增菌；设计特定的有利于待分离菌株生长的环境。
⑴具体如下：
开发意图贯穿分离过程，使培养基“只”满足目的菌的要求，
而非目的菌不长；eg.寻找低温碱性脂肪酶产生菌
大剂量加入同类化合物；eg.酒精酵母
特殊成分；eg.维真生菌素抑、制氨剂基：酸放、线无菌机酮盐、等制霉菌素等；
抑制剂：
细菌抑制剂：青霉素、链霉素； 萘啶酸可抑制革兰氏阴性细菌；
3、目的菌的充分释放；
1、培养基设计原则；
初筛 2、分离方法介绍；
1、获得纯培养； 2、选择目的菌株；
复筛
3、培养条件； 1、霉菌简介；
形态学观察 2、菌落形态；
1、真菌的系统发育谱；
2、微生物快速鉴定技术； 生理生化实验
3、霉菌制片观察；
18SrRNA
分子生物学方法
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一、微生物资源的分布及样本的采集
土壤环境：
每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月为佳；通常采集1040cm深处的土样；若要分离放线菌和真菌，土样应放到无菌牛皮纸袋 中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分离细菌，最好要保湿；
海洋环境及湿地：
0.5μm的滤膜过滤水样，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或 重锤式取样器采集；样品装入无菌瓶内，不能密封，在3h内用于实验；

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斜面接种法
斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种； 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面的纯培养物 接种到斜面培养基上，称为斜面培养； 霉菌的斜面接种：适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛 霉、根霉等）。常用点接法，即点接在斜面中部偏下方； 接种室避免碰到试管壁，防止污染；超净台酒精灯附近操作，注意灼 烧试管口及棉塞； 应斜持试管呈45度角，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养 基表面，造成污染；
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⑵分类
目前，真菌学仍然是微生物学的薄弱环节，还有待进一步深 入研究。在系统学方面，受到公认的分类体系不多。
真菌的类群：
接合菌纲：代表种—毛霉、根霉 子囊菌纲：代表种—酵母菌、羊肚菌 担子菌纲：代表种—鹅膏菌、伞菌 卵菌纲：代表种—异水霉属 半知菌纲：代表种—青霉属、曲霉属、假丝酵母
低等真菌特有
高等真菌特有
根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型： 无隔膜菌丝：无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核，这 是低等真菌所具有的菌丝类型； 有隔膜菌丝：有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个 细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞 之间的细胞质和营养物质可以相互沟通，这是高等真菌所具有的菌丝类型；
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⑵用液体培养基获得纯培养
稀释法：
方法：接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀 释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物；
特点：工作量大，是否获得纯培养依靠统计学的推测；
应用：用于不能或不易在固体上生长的菌落；
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3、培养条件

一植物病原真菌的分离培养及纯化技术
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2）制作步骤
•马铃薯洗净，去皮称200g切块/条， •1000ml水煮沸30min， •用双层纱布滤去薯块， •加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，
•待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中，
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5）将吸干水分的病组织移到预先倒好的PDA平 板上，注意要用镊子轻压组织使其着靠在培养 基上。
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6）每皿5块，均匀摆放，倒置于25℃培养箱中培 养。4-5天后检查结果。写明日期、姓名等。
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各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要根 据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材 料的分离法。
分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，将烟草种
子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种 间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。
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3．组织的表面消毒剂
（1）酒精 用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟到1分
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维管束组织内病原真菌的分离
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从根茎维管束组织分离 病菌，可先将寄主病部表 面用70％酒精擦拭消毒，
将表皮组织用灭菌的解剖刀 削去，然后切取其中小块变 色的维管束组织，用升汞或 漂白粉液消毒后，用灭菌水 冲洗几次，移置培养基面上 。
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比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗8、9 次。

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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
霉菌的分离纯化和鉴定讲解
11、不为五斗米折腰。 12、芳菊开林耀，青松冠岩列。怀此 贞秀姿 ，卓为 霜下杰 。
13、归去来兮，田蜀将芜胡不归。 14、酒能百虑，菊为制颓龄。 15、春蚕收长丝，秋熟靡王税。
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