细胞培养与细胞生死状态的鉴别

死细胞鉴别实验报告引言细胞是生物体的基本单位，而细胞的生死状态对于研究生物体的健康状态和反应至关重要。

因此，鉴别细胞是否存活或死亡是细胞生物学研究中的一个重要方面。

本实验旨在探究几种常用的细胞死亡检测方法，比较它们的原理、优缺点以及适用范围。

材料与方法材料- 死细胞（来源为培养基中存放久的细胞）- 活细胞（来源为新鲜培养的细胞）- Annexin V-FITC/PI 染色试剂盒- MTT（甲基硫代氮唑盐）试剂盒- PI（荧光素）染色试剂盒- 倒置显微镜- 96孔板方法1. Annexin V-FITC/PI 双染法- 取少量活细胞和死细胞，离心去除培养液。

- 用PBS洗涤2次。

- 加入适量Annexin V-FITC染色试剂和PI染色试剂，按试剂盒使用说明操作。

- 由于每种细胞线对于荧光素的增加有所不同，所以需要观察活细胞和死细胞的荧光信号。

- 在倒置显微镜下观察染色细胞。

活细胞通常会呈现绿色荧光，而死细胞则会呈现红色荧光，同时也能观察到双染的细胞。

2. MTT 法- 将活细胞和死细胞分别均匀悬浮在培养基中，制备concentration为1 \times 10^6/mL的细胞悬浮液。

- 取200μL的细胞悬浮液于96孔板孔中，每孔设置3个平行重复。

- 加入MTT试剂，按照试剂盒使用说明操作。

- 倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

- 使用酸解液将MTT染色后的溶液吸出，避免细胞产生二次吸收。

- 使用微孔板阅读器检测各孔的吸光度。

3. PI 染色法- 准备好活细胞和死细胞的悬浮液。

- 取少量细胞悬浮液，在离心管中离心去除培养液。

- 滴加PBS重新悬浮细胞，使得细胞形态变得均匀。

- 加入适量的PI染色试剂，按照试剂盒使用说明操作。

- 通过倒置显微镜观察细胞的形态变化，并记录颜色和荧光信号。

实验结果与讨论Annexin V-FITC/PI 双染法结果在观察活细胞和死细胞样本时，我们发现活细胞产生了明亮的绿色荧光，而死细胞则产生了红色荧光。

如何判断细胞的活性细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,检测方法如下：一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。

可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。

使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。

能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。

其中最常用的是台盼蓝染色法。

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。

通过细胞计数可得出细胞的存活率。

本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。

但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。

2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。

如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。

吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。

溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。

这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。

在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。

而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。

二、克隆（集落）形成试验克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。

一般情况，每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm3之间。

小鼠脾脏细胞培养与细胞生死状态的鉴别实验目的1. 学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。

3.学习细胞生死状态鉴别的方法，原理。

实验原理细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在以下差异：一、细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。

基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。

此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。

活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

二、代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。

基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。

第1页 共6页 第2页 共6页2022学年高考总复习 专题二 细胞的基本结构（满分100分）一、选择题（共20小题，每小题3分，共计60分。

在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。

）1.细胞膜在细胞的生命活动中具有重要作用，下列相关叙述错误的是（ ）A.精卵结合过程与细胞膜的功能有关B.胰岛细胞分泌胰岛素与细胞膜的功能有关C.用台盼蓝鉴别细胞生死的“染色排除法”与细胞膜的功能无关D.保障细胞内部环境的相对稳定与细胞膜的功能有关2.细胞的结构与功能存在密切的联系。

下列有关叙述正确的是（ ）A.酵母菌线粒体内膜凹陷折叠成嵴，有利于葡萄糖分解酶的附着B.吞噬细胞含有丰富的溶酶体，有利于异物的消化清除C.记忆B 细胞含有丰富的高尔基体，有利于抗体的分泌D.低等植物中心体与有丝分裂过程中纺锤体和细胞壁的形成有关 3.下列有关线粒体的叙述，正确的是（ ）①葡萄糖初步降解的场所 ②细胞中必备的细胞器 ③多数真核细胞的动力车间 ④与叶绿体相伴存在 ⑤动物细胞2CO 的生成场所 ⑥遗传物质贮存场所之一 ⑦有氧呼吸的必需场所A.③⑤⑥B.①②⑤⑥C.③④⑥⑦D.①③⑤⑥⑦4.某科学家为了研究细胞核的作用，他把每个细胞都用极细的丝横缢为有细胞核和无细胞核两部分，然后把这些细胞放在同样的条件下培养，结果如图所示。

下列有关叙述错误的是（ ）A.可以证明细胞核是细胞生命活动的控制中心B.有核部分的细胞个别死亡可能是由环境因素造成的C.图中数据说明细胞核与细胞质相互依存、相互制约D.第1天的实验结果不能说明无核部分的生存力比有核 部分的生存力强5.在观察叶绿体的实验中，下列叙述错误的是（ ）A.实验无需撕取叶肉细胞，直接将黑藻幼嫩小叶放在载玻片的水滴中，盖上盖玻片，制成临时裝片B.事先将观察用的黑藻放在温度适宜的黑暗条件下培养C.在光学显微镜的高倍镜下不可看到黑藻叶绿体的双层膜结构D.黑藻叶肉细胞也可用于质壁分离及复原实验6.李斯特氏菌是一种致死食源性细菌，当它侵入人体后，该菌的一种名为InlC 的蛋白可通过抑制人类细胞中的Tuba 蛋白的活性使细胞膜更易变形，从而有利于该菌在人类细胞之间快速转移，使人患脑膜炎。

PI染色方法范文PI染色是一种荧光染色方法，利用PI（propidium iodide）作为染料，结合细胞膜的通透性，可以选择性地染色死亡细胞和已被破坏的细胞。

PI是一种均不透过未破损的细胞膜的小分子染料，但能通过受损细胞膜进入细胞内与核酸结合。

在染色过程中，PI会与细胞核中的DNA结合，使细胞核发出红色荧光，从而能够区分活细胞和死亡细胞。

执行PI染色的步骤如下：1.将待染细胞接种于培养皿或载玻片上，使其附着。

2.将细胞固定，常用的固定剂有4%的乙醛或甲醛溶液，固定后洗涤掉余留的固定剂。

3.将细胞膜破坏剂（如0.1%的Triton X-100）加入细胞上，以使细胞膜通透性增强。

4.加入适量的PI染料溶液，通常浓度为50μg/mL，使其完全覆盖细胞。

5.在黑暗条件下孵育细胞20-30分钟，使染料与DNA结合。

6.将细胞置于荧光显微镜下观察，由于PI与DNA结合后发出红色荧光，可直接看到染色的细胞核。

PI染色方法有很广泛的应用领域。

在细胞培养实验中，PI染色可用于评估细胞的存活率、凋亡和细胞周期分布等。

它还可用于细胞计数、细胞分选和细胞术后RNA提取等实验。

在生物医学研究中，PI染色也被广泛应用于细胞凋亡和细胞死亡机制的研究。

虽然PI染色是一种简单易行的染色方法，但也存在一些优缺点。

其优点包括操作简单、有效性高、可观察到染色的细胞核数量和形态等。

缺点包括染色结果受到细胞膜完整性的影响，不能区分早期凋亡和坏死的细胞，染色结果受背景荧光的干扰较大。

为了克服PI染色的缺点，研究人员在实践中进行了一些改进。

例如，通过引入不同颜色的核酸染料，可用以区别细胞的生死情况。

另外，还可以结合细胞凋亡标记物，如Annexin V，来进一步判断细胞的凋亡状态。

综上所述，PI染色是一种常用的细胞染色方法，通过与DNA结合，使细胞核发出红色荧光，可区分活细胞和死亡细胞。

它具有简单易行、有效性高等优点，在细胞培养和生物医学研究中有广泛应用。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

区分活细胞和死细胞的方法同学们，今天咱们来研究一下怎么区分活细胞和死细胞，这可有意思啦！有一种简单直接的方法，那就是观察细胞的形态。

活细胞通常看起来饱满、有光泽，就像充满活力的小朋友，精神头十足。

而死细胞呢，往往会变得干瘪、皱缩，就像泄了气的皮球。

比如说，我们观察洋葱表皮细胞，如果细胞看起来圆润、透明，那很可能是活的；要是变得皱巴巴、颜色暗淡，那可能就是死了。

还有一种方法是看细胞能不能进行新陈代谢。

活细胞就像一个小工厂，不停地进行着各种化学反应，吸收营养物质，排出废物。

我们可以通过检测细胞对某些物质的吸收或者产生来判断它是不是活着。

比如，给细胞提供一些有颜色的染料，如果活细胞能吸收这些染料，就说明它在进行新陈代谢。

再来说说细胞膜的通透性。

活细胞的细胞膜就像一个聪明的保安，只允许对细胞有用的物质进来，没用的或者有害的就挡在外面。

而死细胞的细胞膜就失去了这种控制能力，什么东西都能随便进出。

我们可以用一些特殊的染料或者试剂来检测细胞膜的通透性，从而判断细胞的生死。

细胞的繁殖能力也是一个重要的指标。

活细胞能够分裂、生长，不断产生新的细胞。

如果我们在显微镜下观察到细胞正在进行分裂，那它肯定是活的。

而死细胞可没有这种本事。

还有一种有趣的方法是台盼蓝染色法。

台盼蓝这种染料一般进不了活细胞，但能进入死细胞，让死细胞染上蓝色。

所以，我们把细胞和台盼蓝染料放在一起，如果细胞被染成蓝色，那就是死细胞；没被染色的就是活细胞。

在观察培养的细胞时，我们用台盼蓝染色，发现大部分细胞没有被染色，只有少数细胞变蓝了，那就说明大部分细胞是活的，少数细胞已经死亡。

通过这些方法，我们就能比较准确地区分活细胞和死细胞啦。

这对于我们研究细胞的生命活动、疾病的发生机制，还有药物的效果等等都非常重要。

想象一下，如果医生不知道怎么区分病变组织中的活细胞和死细胞，就很难制定出有效的治疗方案。

所以，学会区分它们，能帮助我们更好地了解生命的奥秘，解决很多实际的问题呢！。

【实验目的】1、回顾细胞培养的有关知识；2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7、学习实验过程的详细描述及实验记录。

【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。

简述细胞毒实验的基本原理细胞毒实验是一种常用的生物学实验方法，用于评估物质对细胞生存和功能的影响。

通过这种实验，科学家们可以更深入地了解物质的毒性及其对细胞的损害程度。

本文将简要介绍细胞毒实验的基本原理，重点探讨细胞毒性评估中的关键步骤和技术。

1. 细胞毒实验的基本原理细胞毒实验的基本原理是在控制条件下，将细胞与被测试物质接触，观察细胞的生存状态和功能改变，以评估被测试物质对细胞的毒性作用。

通常，这些实验使用培养的细胞系，如小鼠成纤维细胞或人类癌细胞，以替代整个生物体。

2. 关键步骤和技术2.1 细胞培养在进行细胞毒实验之前，科学家首先需要选择适当的细胞系并进行细胞培养。

培养的细胞需要具备一定数量和活力，以确保实验结果的可靠性和可重复性。

2.2 处理样品在进行细胞毒实验时，被测试物质通常以不同的浓度或时间间隔处理细胞。

这个步骤的目的是观察不同浓度或暴露时间下细胞的反应，并确定被测试物质的毒性。

2.3 细胞存活率和细胞损伤评估评估细胞存活率和细胞损伤是细胞毒实验中最关键的步骤之一。

细胞存活率可以通过荧光染料和显微镜观察来确定，而细胞损伤则可以通过测量细胞膜完整性、线粒体功能和染料渗透等指标来评估。

2.4 统计分析在细胞毒实验结束后，科学家需要对实验数据进行统计分析。

常见的统计分析方法包括方差分析和t检验等，以确定不同处理组之间的显著差异。

3. 个人观点和理解细胞毒实验是现代生物学研究中不可或缺的技术手段之一。

通过这种实验方法，科学家们能够系统地评估物质对细胞的影响，并进一步了解其在生命活动中的作用和机制。

对于我来说，细胞毒实验是一种令人着迷的实验技术，它可以帮助我更全面地理解生物体与外界环境之间的相互关系。

总结：细胞毒实验是一种重要的生物学实验方法，通过评估物质对细胞的影响，帮助科学家们了解其毒性和损伤程度。

这个实验的基本原理是将细胞与被测试物质接触并观察细胞的生存状态和功能改变。

关键的实验步骤包括细胞培养、处理样品、细胞存活率和细胞损伤评估，以及统计分析。

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理台盼蓝是一种通过细胞膜渗透进入细胞内部，与细胞核酸结合的染料。

通过这种结合，台盼蓝可以形成与DNA的复合物，并显示在细胞核内。

通常，被存活的细胞吸收的台盼蓝较少，因此细胞核显示浅蓝色。

而死亡的细胞则更容易吸收台盼蓝，导致细胞核变为暗紫色。

基于这个原理，可以通过台盼蓝染色来区分死亡和存活的细胞。

下面是台盼蓝染色的步骤和操作方法：1.准备样本：通过适当的实验操作，准备细胞悬液或细胞培养物样本。

样本可以包括不同类型的细胞，如细菌、动物细胞或植物细胞。

2.取适量样本：取适量的细胞悬液或细胞培养物，并转移至离心管中。

3.离心：用适当的离心速度离心样本，以沉淀细胞。

4.去除上清液：将上清液倒掉，取得细胞沉淀。

5.重悬细胞：向离心管中加入适量的生理盐水或PBS溶液，轻轻搅拌，使细胞沉淀分散均匀。

6.台盼蓝染色：向离心管中加入一定浓度的台盼蓝溶液，充分混匀，使台盼蓝与细胞接触。

7.处理待时间：将样本静置处理一段时间，以确保台盼蓝与细胞充分反应。

8.制备涂片：取一滴台盼蓝处理后的细胞悬液，加到清洁玻璃涂片上。

9.压片：使用另一片玻璃涂片，将细胞悬液均匀地涂布于玻璃涂片上，形成薄层的细胞悬液。

10.观察：将涂片放置在显微镜下，使用高倍镜观察细胞的染色情况。

在台盼蓝染色结果观察过程中，细胞核颜色的浅蓝色代表存活的细胞，而颜色较深的暗紫色代表死亡细胞。

可以利用这个差异对待测细胞进行区分。

此外，台盼蓝染色的结果还可以与其他染色方法相结合，如乙酰肌酸酯酶活性染色，细胞膜完整性等，以更全面地评估细胞状态。

总结来说，台盼蓝染色通过台盼蓝与细胞核DNA的结合，能够区分出存活和死亡细胞，具有操作简便、结果明确的优点。

因此，它在细胞学、细胞毒性研究等领域有着广泛的应用。