当前位置：文档之家 › 实时定量PCR技术

实时定量PCR技术

  • 格式：doc
  • 大小：133.00 KB
  • 文档页数：11

文件名：Gene expression and NF-kB-print.ppt大小：4.4M内容：新加坡国立大学的沈教授给我们浙大研究生上课用的有关NF-kB幻灯,与大家分享文件提取地址:/提取码9359339304429836。

你现在还需要NF-KB引物序列吗？我有,跑的挺漂亮的,下一条为内参RPS16 148bp,上一条为NF-KB,269b p.序列为：Upper Primer5' AGT GTG GAG GCT GCC TTG CGA ATG 3'Lower Primer5' TGG GCT TTC AAG ACT GGA ACG GTC 3'NFKB 10 2008-02-01 13hr 35min.rar(129.16k)。

实时荧光定量PCR具体实验步骤第一种：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rp m 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的7 5%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下700 0rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1: 100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。

样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A2 60 ×稀释倍数×40 ?g/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A26 0 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l ×0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10×MOPS电泳缓冲液和1 8 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。

胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品取3?gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。

5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18 S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

3 样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1 逆转录buffer 2μl2 上游引物0.2μl3 下游引物0.2μl4 dNTP 0.1μl5 逆转录酶MMLV 0.5μl6 DEPC水5μl7 RNA模版2μl8 总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-8 0℃待用。

4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按1 0倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10μl2 阳性模板上游引物F 0.5μl3 阳性模板下游引物R 0.5μl4 dNTP 0.5μl5 Taq酶1μl6 阳性模板DNA 5μl7 ddH2O 32.5μl8 总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系：序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10μl2 内参照上游引物F 0.5μl3 内参照下游引物R 0.5μl4 dNTP 0.5μl5 Taq酶1μl6 待测样品cDNA 5μl7 ddH2O 32.5μl8 总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：序号反应物剂量1 10×PCR缓冲液2.5 ul2 MgCl2 溶液1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液3 ul6 Taq聚合酶1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72?C延伸5分钟。

②PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PC R产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PC R产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6 待测样品的待测基因实时定量PCR①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10 ul2 上游引物1ul3 下游引物1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶2ul6 待测样品cDNA 5ul7 ddH2O 30ul8 总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。

PCR产物与DN A Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

第二种：总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

逆转录合成cDNA反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃冰箱冻存PCR反应混匀快速离心一次PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果第三种：(NF-κB信号通路中炎症因子在慢性致痫大鼠海马的表达及PDTC干预的研究)2．3取材于各时间点在模型组、干预组及对照组各组中随机选取6只大鼠称重，以10％水合氯醛(0．33ml／1009)腹腔麻醉，心脏取血，断头，迅速解剖全脑，DEPC水清洗血迹，冰上分离双侧海马，以锡箔包好贴上标签，液氮速冻并转入．80℃超低温冰箱保存备用。

2．4组织RNA的提取应用天根生化科技(北京)有限公司总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，具体步骤如下：(1)将海马组织按每50．100mg组织加入lml裂解液用匀浆机充分匀浆，总体积不能超过所用裂解液体积的10％；(2)将匀浆样品室温放置5min后，4"C 120009离心5min，取上清液，转入一个新的无Rnase的EP管中；(3)加入0．2ml氯仿，涡旋混匀15秒，室温放置3rain，4。

C 120009离心10min：(4)取上清液，转入一个新的无Rnase的离心管中，缓慢加入O．5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液转入吸附柱CR3中，4。

合集下载

实时定量PCR

实时定量PCR

实时定量PCR概述张璐（武汉轻工大学动物科学与营养工程学院）摘要:实时定量PCR(Real-time Quantitative PolymeraseChainReaction，RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。

该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围。

本文综述了RQ-PCR技术的概念、分类、原理、应用及研究进展。

关键词：实时定量PCR、分类、应用1、实时定量PCR的基本概念及原理介绍1. 1实时定量PCR概念实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. 2涉及的几个术语简介1. 2. 1 荧光域值(threshold)的设定。

PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的l0倍。

1. 2. 2 Ct值它是指PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。

初始量越多其到达指数扩增期的ct值越小。

定量结果虽然不能直接用ct值的大小表示，但可根据不同的公式计算后用于定量结果的表示。

1. 2. 3 扩增效率(E) 当扩增效率最大(E=1)且目的基因与参照物的扩增效率近似相同时实验结果才科学、可信。

因为E值5％的差异就可在26个循环后导致产物2倍的差别[1]，且不同的定量方法对E值要求也不同。

1. 2. 4溶解曲线，即Ct值与起始模板的关系。

研究表明，每个模板的D值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Q值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表D值。

因此。

只要获得未知样品的D值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展

实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展

实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time qPCR）是一种通过荧光信号实时测量PCR产物累积量的技术，可以在PCR反应过程中实时监测PCR 产物的数量。

这种技术结合了常规PCR技术的放大特异性和荧光标记探针的特异性探测，使得PCR分析更加准确、精确。

实时荧光定量PCR技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、细胞检测、突变分析等领域。

下面将分别介绍该技术在不同领域的应用研究进展。

在基因表达分析中，实时荧光定量PCR可用于测量特定基因在不同组织或不同发育阶段中的表达量。

该技术的灵敏度高、动态范围广，并可同时分析多个基因。

通过实时监测PCR产物的累积，可以获得准确的基因表达水平。

实时荧光定量PCR还可以用于研究非编码RNA的表达，如长非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）。

在病原体检测中，实时荧光定量PCR可用于快速、准确地鉴定和定量各类病原体。

各类病毒、细菌、真菌等的快速检测和定量分析。

由于实时荧光定量PCR具有高灵敏度和高特异性，能够在短时间内完成大量样本的分析，广泛应用于临床诊断和食品安全领域。

在细胞检测中，实时荧光定量PCR被用于检测细胞中的特定基因表达水平，并研究基因在细胞中的调控机制。

通过测量细胞内转录因子基因的表达变化，可以了解基因调控网络的变化情况。

在突变分析中，实时荧光定量PCR可用于检测某一基因的突变频率，如药物抗性相关基因的突变频率。

通过实时监测突变型和野生型基因的相对数量，可以计算出突变频率，为个性化药物治疗提供参考。

实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量性等优点，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。

随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，实时荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用前景将更加广阔。

简述实时定量pcr的原理和应用

简述实时定量pcr的原理和应用

简述实时定量PCR的原理和应用1. 实时定量PCR简介实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA 或RNA的技术。

相比传统PCR技术，实时定量PCR可以快速、准确、高灵敏地测量靶分子的数量。

该技术广泛应用于生物医学研究、基因表达、疾病诊断等领域。

2. 实时定量PCR原理实时定量PCR基于传统PCR技术，通过引入荧光探针来实时监测PCR反应的进行。

其基本原理如下：•步骤1：DNA样本的准备与处理。

从待检测的样本中提取DNA，并对其进行纯化和定量。

•步骤2：引物设计和荧光探针制备。

根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针。

•步骤3：PCR反应的进行。

将DNA模板与引物、荧光探针和PCR反应液混合，通过一系列的温度循环对DNA进行扩增。

•步骤4：荧光信号检测与分析。

在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合，并发出荧光信号。

荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，通过荧光信号的实时监测和分析，可以推断出DNA的起始量。

3. 实时定量PCR的应用实时定量PCR广泛应用于许多领域，包括：3.1 基因表达分析实时定量PCR可以定量检测基因在不同组织、不同时期、不同条件下的表达水平变化。

通过相对定量和绝对定量分析，可以研究基因的功能、调控机制及调控因子。

3.2 病原体检测实时定量PCR对病原体的检测具有高度灵敏性和特异性。

通过特异性引物和荧光探针的设计，可以快速、准确地检测病毒、细菌、真菌等病原体。

3.3 疾病诊断实时定量PCR在疾病诊断方面有广泛应用。

例如，它可以检测癌症相关基因的突变、染色体重排等变异，从而为癌症的早期诊断和治疗提供重要参考。

3.4 转基因检测实时定量PCR可以用于转基因生物的快速检测。

利用特异性引物和荧光标记的转基因探针，可以检测食品、农作物中是否存在转基因成分。

3.5 环境监测实时定量PCR可以用于环境中微生物的监测和定量分析。

实时定量PCR中定量的目的

实时定量PCR中定量的目的

实时定量PCR中定量的目的一、概述实时定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量DNA或RNA的浓度。

它能够在短时间内扩增目标序列，并实时监测PCR反应的进程，从而确定起始模板的数量。

实时定量PCR在生物医学研究、临床诊断、农业等领域具有重要的应用价值。

二、定量的目的实时定量PCR的定量目的主要有以下几个方面：1. 精确测量样品中的目标序列含量实时定量PCR能够准确测量样品中目标序列的相对或绝对数量。

通过构建标准曲线，可以将待测样品的荧光信号与已知浓度的标准品进行比较，从而估算出待测样品中目标序列的浓度。

这对于定量分析研究非常重要，尤其是在基因表达研究、病原体检测和定量基因组学等领域。

2. 评估基因表达水平的差异实时定量PCR可以分析不同样品中的基因表达水平的差异。

通过比较不同组织、不同处理、不同时间点等条件下目标基因的表达水平，可以揭示基因功能和调控机制。

这对于生物医学研究、药物开发以及基因工程等领域具有重要意义。

3. 检测病原体的存在和量化实时定量PCR在临床诊断中被广泛应用于病原体的检测和定量。

通过针对病原体特定基因的扩增和定量，可以快速准确地检测出病原体的存在，并根据病原体的数量判断感染程度和疾病的严重程度。

实时定量PCR在临床医学中已经成为一种重要的检测工具。

4. 质量控制实时定量PCR可以用于质量控制，确保PCR反应的准确性和可靠性。

通过引入内参基因或外部质量控制标准，可以监测PCR反应的特异性和效率。

这对于避免假阳性或假阴性结果非常重要，尤其是在诊断和实验室检测中。

三、结语实时定量PCR作为一种高效、准确、快速的分子生物学技术，广泛应用于科研、医学和农业等领域。

通过实时定量PCR，我们能够精确测量样品中的目标序列含量，评估基因表达水平的差异，检测病原体的存在和量化，以及进行质量控制。

这些目的的实现在现代生物科学研究和临床实践中起着至关重要的作用。